Dieser Bericht beschreibt eine Methode, um chronisches experimentelles Autoimmun-Trockenauge in Lewis-Ratten durch Immunisierung mit einer Emulsion von Ratten-Tränendrüsenextrakt, Ovalbumin und komplettem Freund-Adjuvans zu induzieren, gefolgt von der Injektion von Tränendrüsenextrakt und Ovalbumin in die Forniceal-Subconjunctiva und Tränendrüsen Sechs Wochen später.
Trockene Augenkrankheit ist eine sehr häufige Erkrankung, die Morbidität und Gesundheitspflege verursacht und die Lebensqualität verringert. Es besteht ein Bedarf für ein geeignetes Trockenaugen-Tiermodell, um neue Therapeutika zu testen, um die Autoimmun-Trockenaugenbedingungen zu behandeln. Dieses Protokoll beschreibt ein chronisches Autoimmun-Trockenaugen-Rattenmodell. Lewis-Ratten wurden mit einer Emulsion mit Tränendrüsenextrakt, Ovalbumin und komplettem Freund-Adjuvans immunisiert. Eine zweite Immunisierung mit den gleichen Antigenen in unvollständigem Freund-Adjuvans wurde zwei Wochen später verabreicht. Diese Immunisierungen wurden subkutan an der Basis des Schwanzes verabreicht. Um die Immunantwort an der Augenoberfläche und den Triumphdrüsen zu verstärken, wurden in den Forniceal Subconjunctiva und in den Tränendrüsen 6 Wochen nach der ersten Immunisierung Triumphdrüsenextrakt und Ovalbumin injiziert. Die Ratten entwickelten trockene Augenmerkmale, einschließlich reduzierte Tränenproduktion, verringerte Reißstabilität und erhöhte Hornhautschäden. Immune proDie Einreichung durch Durchflusszytometrie zeigte ein Übergewicht von CD3 + -Effektor-Speicher-T-Zellen im Augapfel.
Trockene Augenkrankheit (DED) ist eine multifaktorielle Erkrankung der Tränen und der Augenoberfläche, die zu Symptomen von Unbequemlichkeit, Sehstörungen und Tränenfilminstabilität führt, die zu einer Beschädigung der Augenoberfläche führen können. Es begleitet von einer erhöhten Osmolarität des Tränenfilms und einer Entzündung der Augenoberfläche 1 . Symptome, die mit DED verbunden sind, sind Brennen, Stechen, Korn, Fremdkörpergefühl, Reißen, Augenmüdigkeit und Trockenheit 2 , 3 . Die beiden Hauptursachen von DED sind die Tränenproduktion durch die Tränensekretionsdrüse und die übermäßige Verdunstung des Tränenfilms 4 . Bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen wie Sjogren-Syndrom, systemischem Lupus erythematodes und rheumatoider Arthritis-Immunschwäche an den Meibomdrüsen reduziert die Expression von Lipiden, die für die Reißstabilität essentiell sind. Auch die Immunschädigung der Augenoberfläche verringert die ProduktivitätAuf Mucins, die für die Oberflächenbenetzbarkeit wichtig sind. Gemeinsam verursachen diese Prozesse kumulativ chronisches trockenes Auge 5 , 6 , 7 .
Tränenersatz und entzündungshemmende Therapie sind die Standbeine der Therapie. Allerdings sind aktuelle entzündungshemmende Therapien für DED ( dh Kortikosteroide und Cyclosporin) weitgehend immunsuppressiv, was zu schwerwiegenden Nebenwirkungen 8 , 9 , 10 führt . Es besteht die Notwendigkeit für ein geeignetes Tiermodell, um neue immunomodulatorische Mittel zu testen, um das Autoimmun-Trockenauge zu behandeln.
Mäuse mit spezifischen genetischen Defekten 11 , 12 , 13 , Mäuse ohne spezifische Gene 14 , 15 und transgene Mäuse, die Immunoregulat überexprimierenOry-Gene wurden als Modelle der Autoimmun-Trockenauge verwendet 16 , 17 . Antigen-induzierte Autoimmun-Tiermodelle wurden auch bei Mäusen 18 , Kaninchen 19 und Ratten 20 , 21 beschrieben. Hier beschreiben wir ein Antigen-induziertes Modell des chronischen Autoimmun-Trockenauges. Dieses Modell ist eine Modifikation von zwei früheren Modellen; Eine verwendete Tränendrüsenextrakte, und die zweite verwendete ein Autoantigen ( dh klk1b22) aus den Tränendrüsen 20 , 21 .
Die Erkrankung wurde durch die subkutane Immunisierung von 6 bis 8 Wochen alten weiblichen Lewis-Ratten mit Ovalbumin, komplettem Freund-Adjuvans und einer Emulsion mit Tränendrüsen-Extrakten aus Sprague-Dawley-Ratten induziert (Abbildung 1 ). Eine zweite Immunisierung mit demselben Antigen in unvollständigem Freundschen Adjuvans warZwei Wochen später verabreicht. Um Antigen-spezifische Immunzellen an die Tränendrüse und die Augenoberfläche zu rekrutieren, wurde die Mischung aus Tränendrüsenextrakt und Ovalbumin (1 mg / ml) in die forniceale Subconjunctiva und die Tränendrüsen an der 6. bis 7. Woche injiziert (Abbildung 1 ). Mehr als 85% der Ratten entwickelten charakteristische Merkmale des trockenen Auges 70 Tage nach der ersten Immunisierung. Diese Merkmale beinhalten eine reduzierte Tränenproduktion (Abbildung 2 ), eine erhöhte Hornhautfluoresceinfärbung (Abbildung 3 ) und eine verminderte Reißstabilität (Abbildung 4 ). Die Immunprofile der T-Zellen in den Augäpfeln der normalen Ratten durch die Durchflusszytometrie zeigen ein Übergewicht von CD3 + -Effektor-Speicher-T-Zellen ( 5 und 6 ). Ratten mit autoimmunem DED zeigen eine Zunahme der CD3 + Effektor-Speicher-T-Zellen und eine entsprechende Abnahme der naiven und zentralen Speicher-T-Zellen (Abbildung 6 </stroNg>).
Ein kritischer Schritt dieses Protokolls ist die Gewährleistung der Homogenität der Emulsion. In gut vorbereiteten Emulsionen sind die Antigene vollständig mit Öl beschichtet, was die langsame Freisetzung des injizierten Antigens und die kontinuierliche Immunstimulation sicherstellt. Ein weiteres kritisches Merkmal dieses Protokolls ist die Verwendung von Lewis-Ratten. Lewis-Ratten sind empfindlicher für die Entwicklung von Autoimmunkrankheiten als andere Stämme 27 .
Dieses Protokoll wurde von zwei zuvor veröffentlichten Protokollen modifiziert, die entweder nur Tacrimaldrüsenextrakt oder rekombinante Klk1b22 20 , 21 verwenden. In dem aktuellen Protokoll werden Ovalbumin plus Tränendrüsenextrakt als Antigen verwendet, und antigenspezifische Immunzellen werden von der Augenoberfläche und der Tränendrüse angezogen, wodurch lokale Gewebeschäden verursacht werden. Trockenes Auge entwickelt sich langsam und erreicht nach der anfänglichen Immunisierung ~ 85% pro Tag 48. Antigene Herausforderung an dieAuge und Tränendrüse am Tag 48 verschärft das trockene Auge und sorgt für ihre Chronizität bis zum Tag 70.
Im Vergleich zum rekombinanten Klk1b22 im Klk-induzierten DED-Modell sind der im aktuellen Modell verwendete Tränendrüsenextrakt und Ovalbumin billiger und leichter zu erreichen. Der Tränendrüsenextrakt enthält auch andere Proteine, abgesehen von Klk, die Autoimmunität induzieren können, so dass dieser Extrakt theoretisch stärker ist als die Klk-Methode bei der Induktion von DED. Wir haben auch versucht, die Ratten nur mit Tränendrüsenextrakt zu immunisieren; Obwohl diese immunisierten Ratten DED entwickelten, gab es keine signifikante Zunahme der Effektor-Speicher-T-Zellen in Augapfelgeweben im Vergleich zu Kontrollen.
Die Begrenzung dieser Technik ist, dass es 70 Tage dauert, um das Modell zu erreichen. Effektor-Speicher-T-Zellen sind die Haupt-T-Zell-Teilmengen im normalen Rattenauge. In diesem Modell führt Autoimmun-DED zu einer Erhöhung der CD3 + -Effektor-Speicher-T-Zellen im Augapfel. Drogen, die prefErzielung von Effektor-Speicher-T-Zellen, wie selektive Inhibitoren des Kv1.3-Kaliumkanals, können daher einen therapeutischen Nutzen für die Autoimmun-DED 28 haben .
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken Frau Zinn Min Qi und Dr. Veluchamy Amutha Barathi und ihr Team für ihre Hilfe beim Umgang mit den Tieren. Diese Arbeit wurde von NHIC-I2D-1409007, SingHealth Foundation SHF / FG586P / 2014 und NMRC / CSA / 045/2012 unterstützt.
Reagents | |||
Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermal Scientific | 23227 | |
Mycobacterium tuberculosis H37Ra | Becton, Dickinson and company | 231141 | |
complete Freund's adjuvant | Becton, Dickinson and company | 231131 | |
ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5503-10G | |
incomplete Freund's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506-6X10ML | |
pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P7208-50UG | |
fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Sonicator | Sonics | Vibra-Cell | |
phenol red thread | Tianjin Jingming New Technological development Co. LTD. | NA | |
Stereo microscope with ring light illuminator and camera | Carl Zeiss | NA | |
Micro IV microscope | Phoenix Research Labs | NA |