Summary

A<em> In Vitro</em> Caseum Ensaio de Ligação ao que prevê a penetração da droga na tuberculose Lesões

Published: May 08, 2017
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Summary

Aqui descrevemos um método de diálise de equilíbrio rápido (RED) para medir a ligação do fármaco ao caseu de lesões e cavidades de tuberculose pulmonar. O protocolo também é usado com uma matriz espumosa derivada de macrófagos que é um substituto efetivo do caseu.

Abstract

A erradicação da tuberculose requer regimes medicamentosos que possam penetrar as múltiplas camadas de lesões pulmonares complexas. A distribuição de fármacos nos núcleos caseosos de cavidades e lesões é especialmente crucial porque abrigam subpopulações de bactérias tolerantes a fármacos também vulgarmente referidas como persisters. Os métodos existentes para a medição da penetração de fármaco em lesões de tuberculose envolvem costosos e demorados estudos farmacocinéticos in vivo acoplados a técnicas bioanalíticas ou de imagem. A medida in vitro da ligação do fármaco às macromoléculas de caseu foi proposta como uma alternativa a essas técnicas, uma vez que esta ligação dificulta a difusão passiva de moléculas de fármaco através do caseu. A diálise de equilíbrio rápido é um sistema rápido e confiável para realizar estudos de ligação a proteínas plasmáticas e tecidos. Neste protocolo, usamos um dispositivo de diálise de equilíbrio rápido (RED) para medir a ligação do fármaco a homogenatos de caseu que é excised das lesões e as cavidades de coelhos infectados com tuberculose. O protocolo também descreve como gerar uma matriz de substituição de lípido carregado THP-1 macrófagos para usar em lugar de caseum. Este ensaio de ligação caseum / substituto é uma ferramenta importante na descoberta de drogas tuberculose e pode ser adaptado para ajudar o estudo da distribuição de drogas em lesões ou abcessos causados ​​por outras doenças.

Introduction

O tratamento da doença pulmonar tuberculosa requer distribuição eficaz de fármacos em diferentes tipos de lesões. As lesões necróticas e as cavidades contêm centros caseosos que abrigam subpopulações de bactérias tolerantes a drogas ou "persistentes". 1 , 2 A doença cavitária está associada a taxas de cura inferiores e mau prognóstico. 3 , 4 Estudos anteriores mostraram, usando técnicas quantitativas e de imagem, que a capacidade de penetrar o caseu varia significativamente de uma classe de droga para outra. 5 , 6 Estes métodos, no entanto, exigem o uso de modelos de infecção animal que são lentos e tediosos. Foi concebido um ensaio in vitro que mede a ligação do fármaco ao caseu ex vivo . Verificou-se que esta ligação estava inversamente correlacionada com a penetração do fármaco em granulomas caseosos e, por conseguinte, éusado como uma ferramenta de previsão. 7

Diálise de equilíbrio é considerado como o método padrão de ouro para estudos de ligação de proteína de plasma. O dispositivo rápido equilíbrio de diálise (VERMELHO) proporciona um sistema rápido, fácil de usar e fiáveis ​​para a realização de tais ensaios. 8 O dispositivo é constituído por dois componentes: de utilização única, descartáveis que consistem inserções de 2 câmaras separadas por um cilindro vertical de membrana semi-permeável; e placas de base reutilizáveis ​​que pode armazenar até 48 inserções de cada vez. A membrana de diise tem um 8 kDa de peso molecular de corte (MWCO) que é ideal para estudos de ligação a drogas macromolécula. A razão de área para volume elevada superfície do compartimento da membrana de diálise permite uma rápida e equilibração. Ambos os insertos e a placa de base foram validados para o mínimo de ligação não específica. A combinação do dispositivo VERMELHO com técnicas bioanalíticas fornece estimativas precisas sobre as fracções não ligadas de medicamentos em pLasma 8 , 9

Embora originalmente concebido para medir a ligação às proteínas plasmáticas, o dispositivo RED foi utilizado em vários estudos de ligação de tecidos utilizando homogeneizados. 10 , 11 Neste protocolo, medimos a ligação do fármaco ao caseu, os detritos necróticos excisados ​​das lesões necróticas e cavidades de coelhos infectados com tuberculose. A natureza acelular e não vascular do material caseoso facilita a homogeneização numa suspensão homogénea que é compatível com o ensaio.

Dado que o caseu é tedioso para produzir e difícil de encontrar, o protocolo também foi validado para uso com uma matriz substituta que é preparada a partir de macrófagos espumosos. Os macrófagos derivados de monócitos THP-1 são induzidos com ácido oleico para acumular múltiplos corpos lipídicos que lhes conferem a sua aparência "espumosa". Estas células carregadas de lípidos são colhidas eProcessado para produzir uma matriz que usamos como um substituto de caseu. Este estudo mostrou que a ligação do fármaco a esta matriz substituta se correlaciona bem com a ligação ao caseu, imitando eficazmente o processo in vivo que impede a penetração do fármaco no núcleo caseoso de granulomas e cavidades.

Protocol

Todos os estudos com animais foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde com a aprovação do Comitê Institucional animal Cuidado e Uso do NIAID (NIH), Bethesda, MD. Todos os estudos envolvendo o M. tuberculosis foram realizados num laboratório com nível de segurança biológica de contenção 3 (BSL-3). Modelo Infecção 1. Coelho e Coleção caseum Infect de coelhos Nova Zelândia brancos co…

Representative Results

Usando este protocolo, testámos centenas de compostos de desenvolvimento de tuberculose para a sua eficiência previsto no penetrante caseum. A Figura 1 visualiza os conceitos básicos do ensaio VERMELHO. A membrana de diálise das inserções VERMELHOS permite para pequenas moléculas não ligadas a difundir a partir do dador bem ao receptor bem como, finalmente, atingir um equilíbrio entre os dois compartimentos. As pequenas moléculas que são ligadas a macromolécu…

Discussion

Lesões necróticas pulmonares e cavidades em pacientes infectados com tuberculose contêm subpopulações de bactérias que são recalcitrantes ao tratamento medicamentoso. Os núcleos caseosos destas estruturas são particularmente responsáveis ​​por abrigar estes persisters em um ambiente extracelular. Acredita-se que uma distribuição favorável de agentes anti-bacterianos nestes locais remotos seja um determinante importante da eficácia do fármaco contra a tuberculose. Antes da validação deste protocolo, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Desejamos agradecer à Johnson & Johnson, à TB Alliance, à Astra Zeneca, à Rib-X e à Trius Therapeutics pela prestação de bedaquilina, PA-824 (pré-tonsanida), AZD5847, radezolid e tedizolid, respectivamente. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li e Danielle Weiner forneceram suporte com análise MALDI, métodos bioanalíticos, preparação do substituto caseu, síntese química e isolamento de caseum de coelho. Este trabalho foi realizado com financiamento da Fundação Bill e Melinda Gates, o prêmio # OPP1044966 e OPP1024050 para V. Dartois, NIH Shared Instrumentation Grant S10OD018072, bem como o financiamento conjunto da Fundação Bill e Melinda Gates e Wellcome Trust para um Centro de Excelência Para Lead Optimization para Doenças do Mundo em Desenvolvimento a P. Wyatt.

Materials

New Zealand White Rabbits Covance
HN878 Mycobacterium tuberculosis BEI Resources NR-13647 
Ketathesia (Ketamine) 100mg/mL C3N Henry Schein Animal Health 56344
Anased (Xylazine) 100mg/mL Henry Schein Animal Health 33198
Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution  Virbac 710101
THP-1 monocytic cell line ATCC ATCC TIB-202
175cm² TC-Treated Flask (T175) Fisher Scientific T-3400-175
RPMI 1640 media w/o glutamine Fisher Scientific MT-15-040-CV
Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated  Fisher Scientific SH3091003IR
Hyclone L-glutamine, 200mM Fisher Scientific SH3003401
Cellstar TC dish, 145x20mm, vented Fisher Scientific T-2881-1
Phorbol 12-myristate13-acetate (PMA)  Fisher Scientific BP685-1
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma E6758
Oleic acid  Fisher Scientific ICN15178101
Pierce RED Device Reusable Base Plate Fisher Scientific PI-89811
Pierce RED Device Inserts, 50/box  Fisher Scientific PI-89809
Pierce RED insert removal tool  Fisher Scientific 89812
Adhesive plate seal Fisher Scientific 08-408-240
PBS, pH7.4, 10 X 500 mL (Gibco)  Life Technologies  10010-049
DMSO Sigma 472301
Acetonitrile Sigma 34998
Methanol Sigma 34860
Verapamil hydrochloride Sigma V4629
Diclofenac sodium salt Sigma 93484
Trypan Blue Solution, 0.4% Fisher Scientific 15-250-061
Ethanol, 200 proof Fisher Scientific 04-355-451
2010 Geno/Grinder SPEX SamplePrep 2010
Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads Fisher Scientific 15-340-158
484R Cobalt 60 Irradiator JL Shepard 7810-484-1
INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers Fisher Scientific 22-600-100
Upright Light Microscope Leica DM1000
Binary Liquid Chromatography system Agilent 1260 Multi-compenent
Mass spectrometer AB Sciex 4000

References

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Cite This Article
Sarathy, J. P., Liang, H. H., Weiner, D., Gonzales, J., Via, L. E., Dartois, V. An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions. J. Vis. Exp. (123), e55559, doi:10.3791/55559 (2017).

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