여기에서는 폐결핵 병변 및 충치에서 caseum에 대한 약물 결합을 측정하기위한 신속한 평형 투석 (RED) 방법에 대해 설명합니다. 프로토콜은 또한 caseum에 효과적인 대리 대리인 거품 마크로파지 파생 매트릭스와 함께 사용됩니다.
결핵성 질병 퇴치는 복잡한 폐 병변의 여러 층을 침투 할 수있는 약물 요법을 필요로합니다. 충치 및 병변의 caseous 코어의 약물 분포는 일반적으로 persisters로 알려진 약물 내성 박테리아의 subpopulations을 보유하기 때문에 특히 중요합니다. 결핵 병변에서 약물 침투를 측정하기위한 기존의 방법 은 생체 분석 또는 영상 기술과 결합 된 비용이 많이 들고 시간 소모적 인 생체 내 약물 동태 학 연구를 필요로한다. Caseum macromolecules에 결합하는 약물의 in vitro 측정은 이러한 결합이 caseum을 통한 약물 분자의 수동 확산을 방해하기 때문에 그러한 기술의 대안으로 제안되었다. 신속한 평형 투석은 혈장 단백질 및 조직 결합 연구를 수행하는 빠르고 안정적인 시스템입니다. 이 프로토콜에서 우리는 빠른 평형 투석 (RED) 장치를 사용하여 excis 인 caseum의 균질 액에 대한 약물 결합을 측정했습니다병변 결핵 감염 토끼 공동 에드. 이 프로토콜은 또한 caseum 대신 사용할 THP-1 식세포로드 지질에서 대리 매트릭스를 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 이 caseum / 대리 결합 분석은 결핵 신약 개발에 중요한 도구입니다 및 기타 질병으로 인한 병변이나 농양의 약물 분포를 연구하기 위해 적용 할 수 있습니다.
폐결핵병의 치료에는 약물을 여러 종류의 병변으로 효과적으로 분배해야합니다. Necrotic 병변과 충치는 약물 내성 또는 '영구'박테리아의 subpopulations을 보유 caseous 센터가 포함되어 있습니다. 1 , 2 공동 질환은 열등한 치료율과 나쁜 예후와 관련이 있습니다. 3 , 4 이전의 연구들은 정량적 및 영상 기법을 사용하여 caseum을 투과시키는 능력이 약물 종류에 따라 크게 다르다는 것을 보여주었습니다. 그러나 이러한 방법은 느리고 지루한 동물 감염 모델을 사용해야합니다. 생체 외 caseum에 대한 약물 결합을 측정하는 in vitro 분석이 설계되었습니다. 이 결합은 육아종 육아종의 약물 침투와 역으로 상관 관계가 있으며, 따라서예측 도구로 사용됩니다. 7
평형 투석은 혈장 단백질 결합 연구에 대한 금 기본 접근법으로 간주됩니다. 빠른 평형 투석 (RED) 장치는 그러한 분석을 수행하는 데 빠르고, 사용하기 쉽고 신뢰할 수있는 시스템을 제공합니다. 8 장치는 두 가지 구성 요소로 이루어져 있습니다. 일회용, 일회용 멤브레인의 수직 실린더로 분리 된 2 개의 챔버로 구성된 일회용 인서트. 한 번에 최대 48 개의 인서트를 고정 할 수있는 재사용 가능한베이스 플레이트가 있습니다. 투석막은 약물 – 고분자 결합 연구에 이상적인 8kDa 분자량 컷오프 (MWCO)를 가지고 있습니다. 멤브레인 격실의 높은 표면적 대 부피 비율은 신속한 투석 및 평형을 가능하게합니다. 인서트와베이스 플레이트는 최소한의 비특이적 결합을 위해 검증되었습니다. RED 장치와 생물 분석 기술의 결합은 p에서 약물의 결합되지 않은 분율을 정확하게 추정합니다lasma. 8 , 9
원래 혈장 단백질 결합을 측정하기 위해 고안되었지만 RED 장치는 균질 물질을 사용하는 여러 조직 결합 연구에 사용되었습니다. 이 프로토콜에서는 괴사 성 병변과 결핵에 감염된 토끼의 충치에서 절제 된 괴사 잔해 인 caseum에 대한 약물 결합을 측정합니다. 소포 성 물질의 무 세포 및 비 – 혈관 성질은 분석과 양립 가능한 균질 현탁액으로 균질화하는 것을 용이하게한다.
caseum이 생산이 어려우며 오기가 어렵다는 것을 감안할 때, 의정서는 포말 성 대 식세포로 준비된 대용 매트릭스와 함께 사용하도록 검증되었습니다. THP-1 단핵 세포 유래 대 식세포는 올레산으로 유도되어 여러 개의 지질을 축적하여 '거품'을 일으 킵니다. 이러한 지질로드 된 세포를 수확하고우리가 caseum에 대한 대용 물로 사용하는 행렬을 생성하기 위해 처리됩니다. 이 연구는이 대용 행렬에 대한 약물 결합이 caseum에 결합하는 것과 잘 연관되어 육아종 및 충치의 중대한 코어에서 약물 침투를 방해하는 생체 내 과정을 효과적으로 모방 함을 보여주었습니다.
결핵에 감염된 환자의 폐 괴사 성 병변 및 충치는 약물 치료에 저항력이있는 세균 집단을 포함합니다. 이러한 구조물의 핵심은 세포 외 환경에서 이러한 잔류 물을 보유하는 데 특히 책임이있다. 이러한 원격 위치에 항균제를 유리하게 분배하는 것이 결핵약 효능의 중요한 결정 인자로 여겨진다. 이 프로토콜의 유효성을 검증하기 전에, 소변 병변에서 약물 발견 화합물의 분포를 예측할 수 있?…
The authors have nothing to disclose.
Bedaquiline, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid 및 tedizolid를 제공 한 Johnson & Johnson, TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X 및 Trius Therapeutics에 감사드립니다. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li 및 Danielle Weiner는 MALDI 분석, 생물 분석 방법, caseum 대리인의 준비, 화학 합성 및 토끼 caseum의 분리에 대한 지원을 제공했습니다. 이 작업은 Bill and Melinda Gates Foundation, # OPP1044966 및 OPP1024050 보너스, V. Dartois, NIH Shared Instrumentation Grant S10OD018072 및 Bill and Melinda Gates Foundation의 공동 기금 및 우수 센터를위한 Wellcome Trust의 기금으로 수행되었습니다 개발 도상 세계의 질병에 대한 리드 최적화를 위해 P. Wyatt에게
New Zealand White Rabbits | Covance | – | |
HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
Ketathesia (Ketamine) 100mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
Anased (Xylazine) 100mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
THP-1 monocytic cell line | ATCC | ATCC TIB-202 | |
175cm² TC-Treated Flask (T175) | Fisher Scientific | T-3400-175 | |
RPMI 1640 media w/o glutamine | Fisher Scientific | MT-15-040-CV | |
Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
Hyclone L-glutamine, 200mM | Fisher Scientific | SH3003401 | |
Cellstar TC dish, 145x20mm, vented | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
Phorbol 12-myristate13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
Oleic acid | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
Pierce RED Device Reusable Base Plate | Fisher Scientific | PI-89811 | |
Pierce RED Device Inserts, 50/box | Fisher Scientific | PI-89809 | |
Pierce RED insert removal tool | Fisher Scientific | 89812 | |
Adhesive plate seal | Fisher Scientific | 08-408-240 | |
PBS, pH7.4, 10 X 500 mL (Gibco) | Life Technologies | 10010-049 | |
DMSO | Sigma | 472301 | |
Acetonitrile | Sigma | 34998 | |
Methanol | Sigma | 34860 | |
Verapamil hydrochloride | Sigma | V4629 | |
Diclofenac sodium salt | Sigma | 93484 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads | Fisher Scientific | 15-340-158 | |
484R Cobalt 60 Irradiator | JL Shepard | 7810-484-1 | |
INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers | Fisher Scientific | 22-600-100 | |
Upright Light Microscope | Leica | DM1000 | |
Binary Liquid Chromatography system | Agilent | 1260 | Multi-compenent |
Mass spectrometer | AB Sciex | 4000 |