Summary

Un<em> In vitro</em> Test di rilascio di Caseum che prevede la penetrazione di farmaci nelle lesioni della tubercolosi

Published: May 08, 2017
doi:

Summary

Qui si descrive un metodo rapido equilibrio di dialisi (RED) per misurare farmaco legame caseum da lesioni tubercolosi polmonare e cavità. Il protocollo viene utilizzato anche con una matrice macrofagi derivato schiumosa che è un surrogato efficace caseum.

Abstract

L'eradicazione della malattia di tubercolosi richiede regimi farmacologici che possono penetrare negli strati multipli di lesioni polmonari complesse. La distribuzione dei farmaci nei corpi caseosi delle cavità e delle lesioni è particolarmente cruciale perché ospitano sottopopolazioni di batteri tolleranti ai farmaci comunemente indicati come persistenti. I metodi esistenti per la misura della penetrazione di farmaci nelle lesioni della tubercolosi comportano costi costosi e che richiedono molto tempo gli studi farmacocinetici in vivo accoppiati a tecniche bioanalitiche o di imaging. La misura in vitro della legame di farmaci a macromolecole di caso è stata proposta come un'alternativa a tali tecniche in quanto tale legame ostacola la diffusione passiva delle molecole di farmaco attraverso il caso. La dialisi di equilibrio rapido è un sistema veloce e affidabile per eseguire studi di legame tra proteine ​​plasmatiche e tessuti. In questo protocollo abbiamo usato un dispositivo rapido di dialisi di equilibrio (RED) per misurare il legame dei farmaci a homogenati del casoDalle lesioni e dalle cavità dei conigli infetti da tubercolosi. Il protocollo descrive anche come generare una matrice surrogata da macrofagi THP-1 caricati da lipidi da utilizzare in sostituzione del caso. Questo test di associazione di caso / surrogato è uno strumento importante nella scoperta di droga della tubercolosi e può essere adattato per aiutare a studiare la distribuzione dei farmaci nelle lesioni o negli ascessi causati da altre malattie.

Introduction

Il trattamento della malattia della tubercolosi polmonare richiede una distribuzione efficace di farmaci in diversi tipi di lesioni. Le lesioni e le cavità nocrotiche contengono centri caseosi che ospitano sottopopolazioni di batteri tolleranti o "persistenti". 1 , 2 La malattia cavitaria è associata a tassi di cura inferiori e prognosi scarsa. 3 , 4 Precedenti studi hanno mostrato, utilizzando tecniche quantitative e di imaging, che la capacità di penetrare nel caso è significativamente diversa da una classe di medicinali all'altra. 5 , 6 Questi metodi richiedono tuttavia l'uso di modelli di infezione animale che sono lenti e noiosi. È stato progettato un dosaggio in vitro che misura il legame di farmaci al caso caso ex vivo . Questo legame è stato trovato a correlare inversamente con la penetrazione di farmaci nei granulomi casiosi e, di conseguenza, èUtilizzato come strumento predittivo. 7

La dialisi di equilibrio è considerata come l'approccio standard gold standard per studi di legame proteico plasmatico. Il dispositivo rapido di dialisi di equilibrio (RED) fornisce un sistema veloce, facile da usare e affidabile per eseguire tali analisi. 8 Il dispositivo è costituito da due componenti: inserti monouso, monouso composti da due camere separate da un cilindro verticale di membrana semipermeabile; E piastre base riutilizzabili che possono contenere fino a 48 inserti alla volta. La membrana di dialisi ha un cut-off di peso molecolare di 8 kDa (MWCO) che è l'ideale per studi di legame con farmaci e macromolecole. L'elevato rapporto superficie / volume del compartimento della membrana consente una rapida dialisi e un equilibratura. Sia gli inserti che la piastra di base sono stati convalidati per un minimo legame non specifico. La combinazione del dispositivo RED con tecniche bioanalitiche fornisce accurate stime delle frazioni non legate di farmaci in pLasma. 8, 9

Sebbene originariamente progettato per misurare proteine ​​plasmatiche, il dispositivo RED è stato utilizzato in vari tessuti studi di binding utilizzando omogenati. 10, 11 In questo protocollo, si misurano farmaco legame caseum, i detriti necrotici asportato dalle lesioni necrotiche e cavità di conigli tubercolosi infettati. La natura acellulare e non vascolare di materiale caseoso è facilissimo omogeneizzare in una sospensione omogenea che è compatibile con il saggio.

Dato che caseum è noioso da produrre e difficili da trovare, il protocollo è anche stato convalidato per l'uso con una matrice surrogata che viene preparato da macrofagi schiumosi. THP-1 derivate da monociti macrofagi vengono indotte con acido oleico di accumulare più corpi lipidiche che conferiscono loro aspetto 'schiumosa'. Queste cellule lipidiche-caricati vengono raccolte eelaborati per produrre una matrice che usiamo come surrogato caseum. Questo studio ha dimostrato che farmaci legame a questa matrice surrogata correla bene con legame caseum, mimando efficacemente il processo in vivo che ostacola la penetrazione farmaco nel nucleo caseosa di granulomi e cavità.

Protocol

Tutti gli studi sugli animali sono stati eseguiti in conformità alla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio degli Istituti Nazionali di Salute con l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della NIAID (NIH) di Bethesda, MD. Tutti gli studi riguardanti la M. tuberculosis sono stati eseguiti in un laboratorio con livello di contenimento della biosicurezza 3 (BSL-3). 1. Modello di infezione del coniglio e collezione di Caseum…

Representative Results

Usando questo protocollo, abbiamo testato centinaia di composti di sviluppo della droga della tubercolosi per la loro efficacia prevista a penetrare nel caso. La figura 1 mostra i concetti base del test RED. La membrana di dialisi degli inserti RED permette alle piccole molecole non legate di diffondere dal pozzo del donatore al pozzo del ricevitore, raggiungendo infine un equilibrio tra i due compartimenti. Piccole molecole che sono legate a macromolecole come proteine …

Discussion

lesioni necrotiche polmonari e cavità in pazienti infettati tuberculosis contengono sottopopolazioni di batteri che sono recalcitranti al trattamento farmacologico. I nuclei caseosi di queste strutture sono particolarmente responsabili per ospitare queste persistenti in un ambiente extracellulare. 16 la distribuzione favorevole di agenti anti-batterici in questi luoghi remoti si crede di essere un importante determinante di efficacia della tubercolosi farmaco. Prima della convalida di questo pro…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Desideriamo ringraziare Johnson & Johnson, la TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X e Trius Therapeutics per la fornitura di bedaquiline, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid e tedizolid, rispettivamente. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li e Danielle Weiner fornito supporto con analisi MALDI, metodi bioanalitici, preparazione del surrogato caseum, sintesi chimica, e l'isolamento di coniglio caseum. Questo lavoro è stato condotto con il finanziamento del Fondazione Bill e Melinda, premio # OPP1044966 e OPP1024050 a V. Dartois, NIH Shared Strumentazione di Grant S10OD018072, così come il finanziamento congiunto da parte della Fondazione Bill e Melinda Gates e Wellcome Trust per un centro di eccellenza per l'ottimizzazione di piombo per malattie del mondo in via di sviluppo di P. Wyatt.

Materials

New Zealand White Rabbits Covance
HN878 Mycobacterium tuberculosis BEI Resources NR-13647 
Ketathesia (Ketamine) 100mg/mL C3N Henry Schein Animal Health 56344
Anased (Xylazine) 100mg/mL Henry Schein Animal Health 33198
Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution  Virbac 710101
THP-1 monocytic cell line ATCC ATCC TIB-202
175cm² TC-Treated Flask (T175) Fisher Scientific T-3400-175
RPMI 1640 media w/o glutamine Fisher Scientific MT-15-040-CV
Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated  Fisher Scientific SH3091003IR
Hyclone L-glutamine, 200mM Fisher Scientific SH3003401
Cellstar TC dish, 145x20mm, vented Fisher Scientific T-2881-1
Phorbol 12-myristate13-acetate (PMA)  Fisher Scientific BP685-1
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma E6758
Oleic acid  Fisher Scientific ICN15178101
Pierce RED Device Reusable Base Plate Fisher Scientific PI-89811
Pierce RED Device Inserts, 50/box  Fisher Scientific PI-89809
Pierce RED insert removal tool  Fisher Scientific 89812
Adhesive plate seal Fisher Scientific 08-408-240
PBS, pH7.4, 10 X 500 mL (Gibco)  Life Technologies  10010-049
DMSO Sigma 472301
Acetonitrile Sigma 34998
Methanol Sigma 34860
Verapamil hydrochloride Sigma V4629
Diclofenac sodium salt Sigma 93484
Trypan Blue Solution, 0.4% Fisher Scientific 15-250-061
Ethanol, 200 proof Fisher Scientific 04-355-451
2010 Geno/Grinder SPEX SamplePrep 2010
Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads Fisher Scientific 15-340-158
484R Cobalt 60 Irradiator JL Shepard 7810-484-1
INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers Fisher Scientific 22-600-100
Upright Light Microscope Leica DM1000
Binary Liquid Chromatography system Agilent 1260 Multi-compenent
Mass spectrometer AB Sciex 4000

References

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Cite This Article
Sarathy, J. P., Liang, H. H., Weiner, D., Gonzales, J., Via, L. E., Dartois, V. An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions. J. Vis. Exp. (123), e55559, doi:10.3791/55559 (2017).

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