Summary

La identificación de un epítopo lineal de células B reconocido por anticuerpos monoclonales péptido Escaneo-asistida

Published: March 24, 2017
doi:

Summary

Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

Abstract

La identificación de un epítopo antigénico por el sistema inmune permite la comprensión del mecanismo de protección de anticuerpos neutralizantes que pueden facilitar el desarrollo de vacunas y fármacos peptídicos. de barrido de péptidos es un método simple y eficiente que los mapas de forma directa el epítopo lineal reconocido por un anticuerpo monoclonal (mAb). A continuación, los autores presentan una metodología de determinación epítopo participación de las proteínas truncadas recombinantes en serie, el diseño de péptidos sintéticos, y la hibridación dot-blot para el reconocimiento antigénico de la proteína de cubierta del virus de la necrosis nerviosa utilizando un anticuerpo monoclonal neutralizante. Esta técnica se basa en la hibridación dot-blot de péptidos y mAbs sintéticos sobre una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF). La región antigénica mínima de una proteína de la cubierta viral reconocido por el RG-M56 mAb puede ser reducido a paso a paso recortado mapeo de péptidos en un péptido epítopo 6-mer. Además, barrido de alanina y mutagénesis residuo subinstitución puede llevar a cabo para caracterizar el significado unión de cada residuo de aminoácido que compone el epítopo. Se encontró que los residuos que flanquean el sitio epítopo para jugar un papel crítico en la regulación del péptido conformación. El péptido epítopo identificado puede ser utilizado para formar cristales de complejos de péptido-anticuerpo de epítopo para un estudio de difracción de rayos X y la competencia funcional, o para la terapéutica.

Introduction

En el sistema inmune, la recombinación de los segmentos V, D y J permite anticuerpos para crear enormes variaciones de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) para la unión a diversos antígenos para proteger al huésped de la infección patógena. La defensa de neutralización de anticuerpos contra los antígenos depende de la complementariedad espacial entre las CDR de los anticuerpos y los epítopos de los antígenos. Por lo tanto, la comprensión de esta interacción molecular ayudará diseño vacuna profiláctica y desarrollo de fármacos péptido terapéutico. Sin embargo, esta interacción de neutralización puede estar influenciada tanto por múltiples dominios antigénicos de un antígeno único y de múltiples CDR de anticuerpos, que en consecuencia hacen que el proceso de determinación de epítopo más complejo. Afortunadamente, el desarrollo de la tecnología de hibridoma, que se fusiona células productoras de anticuerpos individuales con células de mieloma, permite para un lote dividen constantemente de las células para secrete un anticuerpo específico, conocido como un anticuerpo monoclonal (mAb) 1. Las células de hibridoma producen estos mAbs, puros de alta afinidad para unirse a un único dominio antigénico de un antígeno específico. Con la relación de la antígeno-anticuerpo establecido, varios enfoques, incluyendo la exploración de péptidos, se puede utilizar para determinar el epítopo de un antígeno utilizando su mAb correspondiente. Los acontecimientos recientes en la tecnología de péptidos sintéticos han hecho que la técnica de exploración de péptidos más accesible y más conveniente para llevar a cabo. En pocas palabras, un conjunto de la superposición de péptidos sintéticos se producen según una secuencia de antígeno objetivo y están asociados a una membrana en un soporte sólido para el mAb hibridación. de barrido de péptidos no sólo ofrece una forma simple de un mapa de la región de unión a anticuerpo, sino que también facilita de aminoácidos (aa) mutagénesis de barrido a través de residuo o sustitución para evaluar la interacción de unión entre cada residuo aa del péptido epítopo y las CDR del anticuerpo.

<p class = "jove_content"> Aquí, el presente estudio describe un protocolo para la identificación eficiente del epítopo lineal de la proteína de la cubierta amarilla mero virus de la necrosis nerviosa (YGNNV) utilizando un anticuerpo monoclonal neutralizante 2, 3, 4. El protocolo incluye mAb preparación, construcción y expresión de proteínas recombinantes en serie truncadas, diseño de péptidos solapantes sintético, la hibridación dot-blot, barrido de alanina, y mutagénesis de sustitución. Teniendo en cuenta el alto costo de la síntesis de péptidos, el paso de truncar en serie las proteínas recombinantes de una proteína diana deseada se modificó, y la región antigénica se redujo a alrededor de 100 a 200 residuos de aa antes de que se realizó el análisis dot-blot array péptido sintético.

Protocol

1. Preparación del anticuerpo monoclonal Cultivar las células de hibridoma monoclonales de ratón RG-M56 2 en medio libre de suero en matraces 175T a 37 ºC con 5% de CO 2 suplemento. Recoger el sobrenadante cuando el color del medio se vuelve amarillo después de cinco días de incubación. NOTA: Las células de hibridoma se cultivaron en medio libre de suero para evitar la contaminación de anticuerpos de suero bovino fetal. Centrifugar el sobrenadante a…

Representative Results

El objetivo de este experimento fue identificar un epítopo a través de transferencia de puntos usando mAb. Para obtener rápida y eficientemente por la región antigénica reconocida por mAb, de longitud completa y proteínas de la cubierta recombinante YGNNV en serie truncado con un marcador de fusión 6xHis en el extremo C-terminal se expresaron a partir de un sistema de expresión de E. coli PET 10 (Figura 1A). Las proteínas recombi…

Discussion

Este protocolo ofrece una técnica rápida y simple para identificar un epítopo lineal mAb-reconocido. Teniendo en cuenta el coste de la síntesis de péptidos y la eficiencia de la producción de péptidos que sintetizan, la región antigénica de la proteína de cubierta del virus se redujo mediante la expresión de proteínas recombinantes en serie truncados antes del análisis de barrido de péptidos. Como tal, se utilizó el sistema de expresión de E. coli pET confiable y eficiente para producir estas pr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Miss Ching-Chun Lin and Miss Diana Lin of the Core Facility of the Institute of Cellular and Organismic Biology (ICOB) of Academia Sinica for offering their expertise on peptide synthesis and DNA sequencing, respectively. This study was supported by Academia Sinica.

Materials

Hybrid-SFM medium Gibco 12045-076
Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) Gibco 21600-069
Pfu DNA Polymerase  Thermo Scientific  EP0502  Including buffers
T4 DNA Ligase Roche 10799009001 Including buffers
NdeI  New England Biolabs R0111S Including buffers
XhoI  New England Biolabs R0146S Including buffers
pET-20b(+) vector Novagen, Merck Millipore 69739
E.coli DH-5α competent cell RBC Bioscience RH617
E.coli BL-21(DE3) competent cell RBC Bioscience RH217
Ampicillin Amresco 0339-25G
LB broth  Invitrongen 12780-052
Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) MDBio, Inc. 101-367-93-1
Methanol Merck Millipore 106009
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) J.T.Baker X251-07
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Glycine Amresco 0167-5KG
Tris Affymetrix, USB 75825
NaCl Amresco 0241-1KG
EDTA Amresco 0105-1KG
Glycerol Amresco 0854-1L
NaN3 Sigma S2002-500G
BCIP/NBT PerkinElmer NEL937001PK
Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody Jackson ImmunoResearch 115-055-008
Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) Merck Millipore IPVH00010
Protein G Agarose Fast Flow Merck Millipore 16-266
QIAquick PCR Purification kit Qiagen 28106
UVP BioSpectrum 600 Image System UVP n/a
VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 UVP n/a
MyCycler thermal cycler BioRad 1709713

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Cite This Article
Chen, C., Chang, C. Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope. J. Vis. Exp. (121), e55417, doi:10.3791/55417 (2017).

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