Summary

Identificação de um epítopo de célula B linear Monoclonal Antibody-péptido reconhecido Digitalização-assistida

Published: March 24, 2017
doi:

Summary

Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

Abstract

A identificação de um epítopo antigénico pelo sistema imunológico permite a compreensão do mecanismo de protecção de anticorpos que podem facilitar o desenvolvimento de vacinas e de drogas peptídicas neutralizantes. Péptido de varrimento é um método simples e eficiente, que diretamente mapeia o epitopo linear reconhecido por um anticorpo monoclonal (mAb). Aqui, os autores apresentam uma metodologia de determinação epitopo envolvendo proteínas em série truncadas recombinantes, design peptídeo sintético, e hibridação dot-blot para o reconhecimento antigênico da proteína de revestimento do vírus da necrose nervoso usando um mAb neutralizante. Esta técnica baseia-se na hibridação dot-blot de péptidos sintéticos e os mAbs em um (PVDF) de membrana de fluoreto de polivinilideno. A região mínima antigénico de uma proteína de revestimento virai reconhecido pelo mAb M56-RG pode ser reduzida por passo-a-passo aparado mapeamento do péptido para um epitopo peptidico 6-mer. Além disso, a mutagénese de varrimento de alanina e o resíduo subtuição pode ser realizado para caracterizar a importância de ligação de cada resíduo de aminoácidos que constituem o epítopo. Os resíduos que flanqueiam o local de epitopo foram encontrados para jogar um papel crítico na regulação da conformação peptídica. O péptido epitopo identificado podem ser usadas para formar cristais de complexos de péptido-anticorpo epitopo para um estudo de difracção de raios-X e a competição funcional, ou para terapêutica.

Introduction

No sistema imunitário, a recombinação de segmentos V, D, J e permite a anticorpos para criar grandes variações de regiões determinantes de complementaridade (CDR) para se ligar a vários antigénios para proteger o hospedeiro contra a infecção patogénica. A defesa de neutralização de anticorpos contra antigénios depende da complementaridade espacial entre as CDR dos anticorpos e os epítopos de antigénios. Portanto, o conhecimento desta interacção irá ajudar molecular concepção de uma vacina profilática e desenvolvimento de fármacos péptido terapêutico. No entanto, esta interacção de neutralização pode ser influenciada tanto por vários domínios antigénicos a partir de um único antigénio e por vários CDRs de anticorpos, os quais, por conseguinte, tornam o processo de determinação epitopo mais complexo. Felizmente, o desenvolvimento da tecnologia do hibridoma, o qual funde a células produtoras de anticorpos com células de mieloma individuais, permite um lote constante dividindo de células para segrete um anticorpo específico, conhecido como um anticorpo monoclonal (mAb) 1. As células de hibridoma produzem estes puros, mAb de elevada afinidade para se ligar a um único domínio antigénico de um antigénio específico. Com a relação do anticorpo-antigénio estabelecida, várias abordagens, incluindo varrimento de péptidos, pode ser utilizado para determinar o epítopo de um antigénio usando o mAb correspondente. Desenvolvimentos recentes na tecnologia peptídeo sintético fizeram a técnica de exploração peptídeo mais acessível e mais conveniente para executar. Resumidamente, uma série de péptidos sintéticos que se sobrepõem são produzidos de acordo com uma sequência do antigénio alvo e estão associados a uma membrana em suporte sido para a hibridação de mAb. digitalização péptido não só oferece uma maneira simples para mapear a região de ligação do anticorpo, mas também facilita o aminoácido (AA) por meio de mutagénese de varrimento resíduo ou substituição para avaliar a interacção de ligação entre cada resíduo AA do péptido epítopo e as CDR do anticorpo.

<p class = "jove_content"> Aqui, o presente estudo descreve um protocolo para a identificação eficiente do epitopo linear da proteína de revestimento garoupa amarelo vírus da necrose nervoso (YGNNV) usando um mAb neutralizante 2, 3, 4. O protocolo inclui mAb preparação, a construção e expressão de proteínas recombinantes em série truncadas, de criação de péptidos sintéticos sobrepostos, hibridação dot-blot, o varrimento de alanina, e mutagénese de substituição. Considerando o elevado custo da síntese de péptidos, o passo de truncagem em série das proteínas recombinantes de uma proteína alvo desejado foi modificado, e a região antigénica foi reduzida para cerca de 100 a 200 resíduos aa antes da análise dot-blot matriz peptídica sintética foi realizada.

Protocol

1. Preparação de Anticorpos Monoclonais Cultura dos monoclonais de rato células de hibridoma RG-M56 2 em meio livre de soro em frascos de 175T a 37 ºC com 5% de suplemento de CO 2. Recolhe-se o sobrenadante quando a cor do meio torna-se amarelo após cinco dias de incubação. NOTA: As células de hibridoma foram cultivadas em meio isento de soro a fim de evitar a contaminação de anticorpos a partir de soro fetal de bovino. Centrifuga-se o sobrenadante…

Representative Results

O objetivo deste experimento foi identificar um epitopo através Dot blot usando mAb. Para limitar rapidamente e eficientemente para baixo da região antigénica reconhecido por mAb, a todo o comprimento e proteínas de revestimento recombinante YGNNV truncados em série com uma marcação de fusão 6xHis no terminal C foram expressos a partir de um sistema de expressão de E. coli de PET 10 (Figura 1A). As proteínas recombinantes result…

Discussion

Este protocolo oferece uma técnica rápida e simples para identificar um epitopo linear reconhecido-mAb. Tomando em consideração o custo da síntese de péptidos e da eficiência da produção de péptidos que sintetizam, da região antigénica da proteína de revestimento de vírus foi reduzido por expressão de proteínas recombinantes em série truncados antes da análise de varrimento de péptidos. Como tal, o sistema de expressão pET de E. coli fiável e eficiente foi usado para produzir estas proteín…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Miss Ching-Chun Lin and Miss Diana Lin of the Core Facility of the Institute of Cellular and Organismic Biology (ICOB) of Academia Sinica for offering their expertise on peptide synthesis and DNA sequencing, respectively. This study was supported by Academia Sinica.

Materials

Hybrid-SFM medium Gibco 12045-076
Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) Gibco 21600-069
Pfu DNA Polymerase  Thermo Scientific  EP0502  Including buffers
T4 DNA Ligase Roche 10799009001 Including buffers
NdeI  New England Biolabs R0111S Including buffers
XhoI  New England Biolabs R0146S Including buffers
pET-20b(+) vector Novagen, Merck Millipore 69739
E.coli DH-5α competent cell RBC Bioscience RH617
E.coli BL-21(DE3) competent cell RBC Bioscience RH217
Ampicillin Amresco 0339-25G
LB broth  Invitrongen 12780-052
Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) MDBio, Inc. 101-367-93-1
Methanol Merck Millipore 106009
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) J.T.Baker X251-07
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Glycine Amresco 0167-5KG
Tris Affymetrix, USB 75825
NaCl Amresco 0241-1KG
EDTA Amresco 0105-1KG
Glycerol Amresco 0854-1L
NaN3 Sigma S2002-500G
BCIP/NBT PerkinElmer NEL937001PK
Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody Jackson ImmunoResearch 115-055-008
Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) Merck Millipore IPVH00010
Protein G Agarose Fast Flow Merck Millipore 16-266
QIAquick PCR Purification kit Qiagen 28106
UVP BioSpectrum 600 Image System UVP n/a
VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 UVP n/a
MyCycler thermal cycler BioRad 1709713

References

  1. Milstein, C., Kohler, G. Clonal variations of myelomatous cells (proceedings). Minerva Med. 68 (50), 3453 (1977).
  2. Lai, Y. S., et al. In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel). J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).
  3. Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection. PLoS One. 10 (5), 0126121 (2015).
  4. Lai, Y. -. S., et al. Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue. J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).
  5. Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus. Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).
  6. Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnol. 11, 24 (2011).
  7. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
  8. Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields. PLoS One. 11 (8), e0160509 (2016).
  9. Metzker, M. L. Emerging technologies in DNA sequencing. Genome Res. 15 (12), 1767-1776 (2005).
  10. Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody. Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).
  11. Atassi, M. Z. Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites. Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).
  12. Opuni, K. F., et al. Mass spectrometric epitope mapping. Mass Spectrom Rev. , (2016).
  13. Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A., Liao, I. C., Leaño, E. M. . The Aquaculture of Groupers. , 207-224 (2008).
  14. Conti-Tronconi, B. M., et al. Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite. Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).
  15. Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes. Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).
  16. Chen, N. C., et al. Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection. PLoS Pathog. 11 (10), e1005203 (2015).
  17. Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity. Biochim Biophys Acta. , (2014).
  18. Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides. AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).

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Cite This Article
Chen, C., Chang, C. Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope. J. Vis. Exp. (121), e55417, doi:10.3791/55417 (2017).

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