Summary

L'identification d'un épitope linéaire des cellules B monoclonales d'anticorps reconnus par le peptide à balayage assistée

Published: March 24, 2017
doi:

Summary

Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

Abstract

L'identification d'un epitope antigénique par le système immunitaire permet la compréhension du mécanisme de protection d'anticorps neutralisants qui peuvent faciliter le développement de vaccins et de médicaments peptidiques. balayage peptidique est une méthode simple et efficace qui mappe carrément l'épitope linéaire reconnu par un anticorps monoclonal (mAb). Ici, les auteurs présentent une méthodologie de détermination de l'épitope impliquant des protéines recombinantes en série tronquées, la conception de peptides synthétiques et hybridation dot-blot pour la reconnaissance antigénique du virus de la nécrose nerveuse protéine d'enveloppe en utilisant un mAb neutralisant. Cette technique repose sur l'hybridation dot-blot de peptides synthétiques et des mAb sur un fluorure de polyvinylidène (PVDF). La région antigénique minimum d'une protéine d'enveloppe virale reconnue par le RG-M56 mAb peut être réduite par l'étape par étape taillée cartographie peptidique sur un épitope de peptide 6-mer. En outre, le balayage d'alanine mutagenèse et les résidus sousconstitution peut être effectuée pour caractériser l'importance de liaison de chaque résidu d'acides aminés constituant l'épitope. Les résidus flanquant le site d'épitope ont été trouvés à jouer un rôle critique dans la régulation peptide de conformation. Le peptide d'épitope identifié peut être utilisé pour former des cristaux de complexes peptide-anticorps épitope pour une étude de diffraction des rayons X et de la compétition fonctionnelle ou pour la thérapeutique.

Introduction

Dans le système immunitaire, la recombinaison V, D et J pour les anticorps segments permet de créer des variations considérables des régions déterminant la complémentarité (CDR) pour la liaison à des antigènes différents pour protéger l'hôte contre une infection pathogène. La défense de neutralisation des anticorps dirigés contre des antigènes dépend de la complémentarité spatiale entre les CDRs de l'anticorps et les épitopes des antigènes. Par conséquent, une compréhension de cette interaction moléculaire facilitera la conception d'un vaccin prophylactique et le développement peptide médicament thérapeutique. Cependant, cette interaction de neutralisation peut être influencée à la fois par de multiples domaines antigéniques à partir d'un seul antigène et par plusieurs CDR d'anticorps, ce qui rend par conséquent le procédé de détermination de l'épitope plus complexe. Heureusement, le développement de la technologie des hybridomes, qui fusionne les cellules productrices d'anticorps individuelles avec des cellules de myélome, permet de diviser un lot de cellules en permanence à secrete un anticorps spécifique, connu comme un anticorps monoclonal (mAb) 1. Les cellules d'hybridome produisent ces mAb, à haute affinité pures pour se lier à un domaine antigénique unique d'un antigène spécifique. La relation de l'antigène-anticorps mis en place, plusieurs approches, y compris le balayage des peptides, peut être utilisé pour déterminer l'épitope d'un antigène en utilisant son anticorps monoclonal correspondant. Les développements récents dans la technologie de peptide synthétique ont fait la technique de balayage de peptide plus accessible et plus commode d'exécuter. En bref, un ensemble de peptides synthétiques se chevauchant sont produites selon une séquence de l'antigène cible et sont associés à une membrane supporté sur un solide pour mAb hybridation. balayage Peptide non seulement offre un moyen simple pour cartographier la région de liaison de l'anticorps, mais facilite également l'acide aminé (aa) la mutagenèse par balayage de résidus ou de substitution pour évaluer l'interaction de liaison entre chaque résidu aa du peptide d'épitope et les CDR de l'anticorps.

<p class = "jove_content"> Ici, la présente étude décrit un protocole pour l'identification efficace de l'épitope linéaire du mérou jaune virus de la nécrose nerveuse (YGNNV) protéine d'enveloppe en utilisant une neutralisation mAb 2, 3, 4. Le protocole comprend mAb préparation, la construction et l'expression de protéines recombinantes tronquées en série, la conception de peptides se chevauchant de synthèse, hybridation dot-blot, le balayage d'alanine et la mutagenèse par substitution. Compte tenu du coût élevé de la synthèse peptidique, l'étape consistant à tronquer en série les protéines recombinantes d'une protéine cible souhaitée a été modifiée, et la région antigénique a été réduit à environ 100 à 200 résidus aa avant la synthèse réseau peptidique analyse dot-blot a été réalisée.

Protocol

1. Préparation de l'anticorps monoclonal Culture les RG-M56 cellules hybridomes monoclonaux de souris 2 dans un milieu sans sérum dans des flacons de 175T à 37 ° C avec 5% de CO 2 supplément. Recueillir le surnageant lorsque la couleur du milieu devient jaune après cinq jours d'incubation. REMARQUE: Les cellules d'hybridome sont cultivées dans un milieu exempt de sérum pour éviter la contamination anticorps à partir du sérum de foetus bovin. </l…

Representative Results

Le but de cette expérience était d'identifier un épitope par dot blot en utilisant mAb. Pour affiner rapidement et efficacement en bas de la région antigénique reconnu par mAb, la pleine longueur et YGNNV protéines d'enveloppe recombinante en série tronquée avec une fusion tag 6xHis à l'extrémité C-terminale ont été exprimées à partir d' un système d'expression E. coli PET 10 (figure 1A). Les protéines…

Discussion

Ce protocole offre une technique simple et rapide pour identifier un épitope linéaire mAb reconnu. Prenant en considération le coût de la synthèse peptidique et l'efficacité des peptides de synthèse de la production, de la région antigénique de la protéine d'enveloppe du virus a été réduite par l'expression de protéines recombinantes tronquées en série avant l'analyse de balayage de peptides. En tant que tel, le système d'expression pET de E. coli fiable et efficace a été …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Miss Ching-Chun Lin and Miss Diana Lin of the Core Facility of the Institute of Cellular and Organismic Biology (ICOB) of Academia Sinica for offering their expertise on peptide synthesis and DNA sequencing, respectively. This study was supported by Academia Sinica.

Materials

Hybrid-SFM medium Gibco 12045-076
Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) Gibco 21600-069
Pfu DNA Polymerase  Thermo Scientific  EP0502  Including buffers
T4 DNA Ligase Roche 10799009001 Including buffers
NdeI  New England Biolabs R0111S Including buffers
XhoI  New England Biolabs R0146S Including buffers
pET-20b(+) vector Novagen, Merck Millipore 69739
E.coli DH-5α competent cell RBC Bioscience RH617
E.coli BL-21(DE3) competent cell RBC Bioscience RH217
Ampicillin Amresco 0339-25G
LB broth  Invitrongen 12780-052
Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) MDBio, Inc. 101-367-93-1
Methanol Merck Millipore 106009
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) J.T.Baker X251-07
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Glycine Amresco 0167-5KG
Tris Affymetrix, USB 75825
NaCl Amresco 0241-1KG
EDTA Amresco 0105-1KG
Glycerol Amresco 0854-1L
NaN3 Sigma S2002-500G
BCIP/NBT PerkinElmer NEL937001PK
Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody Jackson ImmunoResearch 115-055-008
Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) Merck Millipore IPVH00010
Protein G Agarose Fast Flow Merck Millipore 16-266
QIAquick PCR Purification kit Qiagen 28106
UVP BioSpectrum 600 Image System UVP n/a
VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 UVP n/a
MyCycler thermal cycler BioRad 1709713

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Cite This Article
Chen, C., Chang, C. Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope. J. Vis. Exp. (121), e55417, doi:10.3791/55417 (2017).

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