A reference measurement procedure for the absolute quantification of Aβ1-42 in human CSF based on solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry is described.
Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the diagnosis of AD is based on cognitive tests and mental state exams, but the peptide amyloid-beta (Aβ) in cerebrospinal fluid (CSF) is increasingly used in clinical trials and settings. As for most protein and peptide biomarkers, quantification is performed using antibody-based techniques, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, intra- and inter-laboratory variability in these assays hamper its use as a diagnostic marker in clinical routine.
An antibody-independent Reference Measurement Procedure (RMP) was developed based on solid-phase extraction (SPE) and liquid chromatography (LC)-tandem mass spectrometry (MS/MS), where stable, isotope-labeled Aβ peptides were used as internal standards, enabling absolute quantification. A high-resolution quadrupole-orbitrap hybrid instrument was used for the measurements. The method allows for the quantification of CSF Aβ1-42 between 150-4,000 pg/mL.
A doença de Alzheimer (DA) é a forma mais comum de demência e afeta cerca de 35 milhões de pessoas em todo o mundo 1. As características neuropatológicas da doença que se acredita estar no cerne da AD patogênese são emaranhados neurofibrilares intracelulares de proteína tau hiperfosforilada 2 e placas extracelulares que consiste em (Ap) peptídeos 3 agregada beta-amilóide. Em consonância com isso, a avaliação da patologia de placa in vivo por biomarcadores foi recentemente incluída nos critérios diagnósticos para pesquisa em 4 dC. Para medições de CSF de Ap 1-42, vários imunoensaios estão disponíveis e são utilizados em muitos laboratórios clínicos 5. A concentração de Ap em CSF 1-42 é, aproximadamente, 50% mais baixa em pacientes com AD do que em pessoas idosas cognitivamente normais, reflectindo a deposição do péptido em placas na BRain 6, 7.
Esses biomarcadores são principalmente analisadas através de imunoensaios (isto é, técnicas à base de anticorpos), mas estes ensaios podem ser influenciadas por efeitos de matriz 8. O uso de imunoensaios em diferentes plataformas tecnológicas e a falta de ensaio padronização 9, 10 torna a introdução de concentrações de corte globais difíceis 11, 12. Um PGR analiticamente validado permitiria a calibração uniforme das diferentes plataformas de ensaio, de preferência, resultando em melhor comparabilidade entre plataformas analíticas e no melhor controle dos fatores que contribuem para a variabilidade global medição.
A quantificação absoluta de Ap 1-42 utilizando o método de LC-MS / MS desenvolvido supera muitos dos problemas associados com Techn à base de anticorpoiques. O método, listado como um PGR pelo Comité Misto de Rastreabilidade na Medicina Laboratorial (JCTLM banco de dados identificação do número C11RMP9), será utilizado para determinar a concentração absoluta de Ap 1-42 em um material de referência certificado (CRM) para harmonizar CSF Ap 1 -42 medições através de técnicas analíticas e plataformas. O fluxo de trabalho descrito deverá ser de relevância para o desenvolvimento de métodos de referência candidato para peptídeos e proteínas dentro de outras áreas da medicina.
Para o método descrito, em vez de usar uma matriz substituta, foi utilizada a abordagem de substituição analito 13, 14, 15, 16, o que permite a calibração em CSF humano. A abordagem envolve duas analito substituto padrões marcados isotopicamente diferentes. Um (15 NAβ 142) é usado para gerar a curva de calibração em CSF humano, enquanto a outra (13 CA…
The authors have nothing to disclose.
This work was performed on behalf of the International Federation of Clinical Chemistry Working Group on CSF Proteins, which has the following composition: Kaj Blennow (Chair) and Henrik Zetterberg, Gothenburg University, Sweden; Les Shaw and Magdalena Korecka, University of Philadelphia, PA, USA; Ingrid Zegers, Institute for Reference Materials and Measurements, Geel, Belgium; Piotr Lewczuk, Universitätsklinikum Erlangen, Germany; and Rand Jenkins, PPD Bioanalytical Laboratory, Richmond, VA, USA; Randall Bateman, Washington University, MO, USA; and H Vanderstichele, Innogenetics NV, Ghent, Belgium. This work was also part of the Global Consortium for Biomarker Standardization CSF Reference Methods Working Group, which is led by Maria C. Carrillo, Ph.D., Senior Director, Medical & Scientific Relations, Alzheimer’s Association. The study was supported by The Swedish Research Council (grants #14002, #521-2011-4709, and #2013-2546); the Knut and Alice Wallenberg Foundation; Demensförbundet; and Emil and Wera Cornell’s, Aina Wallström and Mary-Ann Sjöblom’s, Gun and Bertil Stohne’s, Magnus Bergvall’s, and Gamla Tjänarinnor’s Foundations.
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 022431102 | |
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL | Eppendorf | 0030 108.310 | |
Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96 | Eppendorf | 951032905 | |
Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom | Micronic | MPW32071BC3 | Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates. |
Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes | Micronic | MP53026 | Caps for Micronic tubes. |
Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded | Micronic | MPW51015BC3 | Holder for Micronic tubes. |
Biohit Optifit tips 1.2 mL | Sartorius | 791210 | Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well. |
Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate | Waters | 186001830BA | |
Waters Plate manifold reservoir tray | Waters | WAT058942 | |
Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters | 186001831 | |
Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis | Sigma-Aldrich | 30501-1L-D | |
Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L | Fisher Scientific | A/0627/17X | |
ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur | Merck Millipore | 1005731000 | |
Guanidine Hydrochloride, 500 g | Thermo Scientific | 24110 | |
Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler. |
Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm) | Dionex | 066640 | |
Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated | Sigma-Aldrich | B6917 | |
Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA | rPeptide | A-1002-2 | |
15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1102-2 | |
13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1106-2 | |
Microplate shakers, TiMix 2 | Edmund Bühler | 6110 000 |