A reference measurement procedure for the absolute quantification of Aβ1-42 in human CSF based on solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry is described.
Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the diagnosis of AD is based on cognitive tests and mental state exams, but the peptide amyloid-beta (Aβ) in cerebrospinal fluid (CSF) is increasingly used in clinical trials and settings. As for most protein and peptide biomarkers, quantification is performed using antibody-based techniques, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, intra- and inter-laboratory variability in these assays hamper its use as a diagnostic marker in clinical routine.
An antibody-independent Reference Measurement Procedure (RMP) was developed based on solid-phase extraction (SPE) and liquid chromatography (LC)-tandem mass spectrometry (MS/MS), where stable, isotope-labeled Aβ peptides were used as internal standards, enabling absolute quantification. A high-resolution quadrupole-orbitrap hybrid instrument was used for the measurements. The method allows for the quantification of CSF Aβ1-42 between 150-4,000 pg/mL.
مرض الزهايمر (م) هو الشكل الأكثر شيوعا من الخرف ويصيب حوالي 35 مليون شخص في جميع أنحاء العالم 1. بصمات عصبية مرضية من مرض يعتقد على نطاق واسع تكمن في جوهر م المرضية هي التشابك الليفي العصبي بين الخلايا من hyperphosphorylated بروتين تاو 2 ولويحات خارج الخلية التي تتكون من (Aβ) الببتيد 3 المجمعة اميلويد بيتا. وتماشيا مع هذا، وقد تم مؤخرا شملت تقييم أمراض الترسبات في الجسم الحي من المؤشرات الحيوية في المعايير البحوث التشخيصية لمدة 4 م. لقياس السائل النخاعي من Aβ 1-42، هي عدة المناعية المتاحة وتستخدم في العديد من المختبرات السريرية 5. تركيز Aβ 1-42 في السائل النخاعي هو أقل ما يقرب من 50٪ في المرضى ميلادي مما كانت عليه في كبار السن الطبيعي معرفيا، مما يعكس ترسب الببتيد في لويحات رعين 6 و 7.
ويتم تحليل هذه المؤشرات الحيوية بشكل رئيسي باستخدام المناعية (أي التقنيات المعتمدة الضد)، ولكن قد تتأثر هذه المقايسات من الآثار مصفوفة 8. استخدام المناعية على منصات التكنولوجيا المختلفة وعدم وجود فحص التقييس 9، 10 يجعل إدخال العالمية تركيزات قطع الصعبة 11 و 12. ومن شأن RMP التحقق من صحة تحليلي تسمح معايرة موحدة للمنصات فحص مختلفة، مما أدى مثالي في المقارنة أفضل عبر منصات التحليلية وفي تحسين السيطرة على العوامل التي تساهم في تقلب قياس العام.
الكمي المطلق للAβ 1-42 باستخدام ضعت طريقة LC-MS / MS يتغلب على العديد من القضايا المرتبطة ميتاليك القائم على الأجسام المضادةiques. سيتم استخدام طريقة، على النحو الوارد في الشرطة العسكرية الملكية من قبل اللجنة المشتركة للتتبع في طب المختبرات (JCTLM قاعدة بيانات تحديد عدد C11RMP9)، لتحديد تركيز المطلق للAβ 1-42 في المراجع معتمد (CRM) لتنسيق CSF Aβ 1 قياسات -42 عبر تقنيات ومناهج تحليلية. وينبغي أن يكون سير العمل وصفه ذات الصلة لتطوير أساليب مرشح مرجعية لالببتيدات والبروتينات داخل مناطق أخرى من الأدوية.
للتعرف على طريقة وصفها، بدلا من استخدام مصفوفة البديلة، استخدمنا نهج بديل تحليلها 13، 14، 15، 16، والتي تمكن المعايرة في السائل النخاعي البشري. ينطوي على نهج تحليلها البديل مختلفين معايير المسمى isotopi…
The authors have nothing to disclose.
This work was performed on behalf of the International Federation of Clinical Chemistry Working Group on CSF Proteins, which has the following composition: Kaj Blennow (Chair) and Henrik Zetterberg, Gothenburg University, Sweden; Les Shaw and Magdalena Korecka, University of Philadelphia, PA, USA; Ingrid Zegers, Institute for Reference Materials and Measurements, Geel, Belgium; Piotr Lewczuk, Universitätsklinikum Erlangen, Germany; and Rand Jenkins, PPD Bioanalytical Laboratory, Richmond, VA, USA; Randall Bateman, Washington University, MO, USA; and H Vanderstichele, Innogenetics NV, Ghent, Belgium. This work was also part of the Global Consortium for Biomarker Standardization CSF Reference Methods Working Group, which is led by Maria C. Carrillo, Ph.D., Senior Director, Medical & Scientific Relations, Alzheimer’s Association. The study was supported by The Swedish Research Council (grants #14002, #521-2011-4709, and #2013-2546); the Knut and Alice Wallenberg Foundation; Demensförbundet; and Emil and Wera Cornell’s, Aina Wallström and Mary-Ann Sjöblom’s, Gun and Bertil Stohne’s, Magnus Bergvall’s, and Gamla Tjänarinnor’s Foundations.
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 022431102 | |
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL | Eppendorf | 0030 108.310 | |
Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96 | Eppendorf | 951032905 | |
Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom | Micronic | MPW32071BC3 | Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates. |
Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes | Micronic | MP53026 | Caps for Micronic tubes. |
Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded | Micronic | MPW51015BC3 | Holder for Micronic tubes. |
Biohit Optifit tips 1.2 mL | Sartorius | 791210 | Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well. |
Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate | Waters | 186001830BA | |
Waters Plate manifold reservoir tray | Waters | WAT058942 | |
Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters | 186001831 | |
Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis | Sigma-Aldrich | 30501-1L-D | |
Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L | Fisher Scientific | A/0627/17X | |
ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur | Merck Millipore | 1005731000 | |
Guanidine Hydrochloride, 500 g | Thermo Scientific | 24110 | |
Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler. |
Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm) | Dionex | 066640 | |
Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated | Sigma-Aldrich | B6917 | |
Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA | rPeptide | A-1002-2 | |
15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1102-2 | |
13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1106-2 | |
Microplate shakers, TiMix 2 | Edmund Bühler | 6110 000 |