Questo protocollo descrive l’uso di tamponi di pozzetto e analisi dei fanghi, dei sistemi di zebrafish, che conduce alla rilevazione aumentata rispetto all’utilizzo esclusivo di sentinelle per rilevare gli agenti patogeni quali Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. e Tomentosa di Pseudocapillaria. Viene proposto anche un sistema per monitorare le uova p. tomentosa in quarantena.
Sistemi di monitoraggio di salute vengano sviluppati e utilizzati in strutture di ricerca di zebrafish, perché gli agenti patogeni di Danio rerio quali Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. e Pseudocapillaria tomentosa hanno il potenziale di compromettere la ricerca e benessere degli animali. I pesci sono in genere analizzati post-mortem per rilevare i microbi. L’uso di sentinelle è un modo suggerito per migliorare la sensibilità della sorveglianza e per ridurre il numero di animali per assaggiare. L’impostazione di un serbatoio di pre-filtrazione sentinella fuori di un sistema di ricircolo è descritto. La tecnica è sviluppata per prevenire l’inquinamento delle acque e di rappresentare la popolazione di pesci da un’attenta selezione di età, sesso e ceppi. Per poter utilizzare il minimo numero di animali, tecniche di schermare l’ambiente sono anche dettagliate. Polymerase Chain Reaction (PCR) su tamponi di superficie pozzetto viene utilizzato per migliorare significativamente la rilevazione di alcune specie micobatterica prevalente e patogeni quali Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium haemophilume I chelonae del micobatterio. Un altro metodo ambientale consiste nell’elaborazione i fanghi nella parte inferiore di un serbatoio o il pozzetto per cercare le uova p. tomentosa . Si tratta di una tecnica a buon mercato e veloce che può essere applicata in quarantena dove un dispositivo di allevamento è sommersa nel serbatoio di ritenzione degli animali importati. Infine, PCR è applicato al campione dei fanghi e a. hydrophila è rilevato al basso e la superficie del pozzetto. Generalmente, queste tecniche di screening ambientale applicate a questi patogeni specifici hanno portato ad una maggiore sensibilità rispetto ai test di pre-filtrazione sentinelle.
Al fine di proteggere la ricerca e benessere degli animali1,2, la presenza di agenti patogeni viene monitorata all’interno di strutture per animali. Nel caso di zebrafish,3,4,5,6,7,8,9,10,11 di monitoraggio dello stato spesso si basa su animali analizzati post-mortem di istopatologia, cultura di batteriologia o metodi molecolari. Test solo animali di Colonia non è il metodo consigliato a causa del numero di pesci e relative spese che sarebbero necessari per rilevare gli agenti patogeni di bassa prevalenza. Di conseguenza, il metodo preferito consiste nell’esporre un piccolo gruppo di animali a un più alto carico di contaminanti. Questi pesci sono chiamati pre-filtrazione sentinelle. Questa esposizione dura per mesi e comporta un aumento del carico di lavoro di cura degli animali e/o qualche soluzione di ingegneria costruito appositamente. Un’altra sfida è la proiezione di linee importate in quarantena dove gli animali fertili sono debba essere mantenuto in vita e questo non è compatibile con le analisi di routine sulle carcasse.
Qui descriviamo alcuni metodi per rilevare determinati patogeni di zebrafish (a. hydrophila, Mycobacterium spp. e p. tomentosa) di ambiente di sistema acquatico di screening. L’obiettivo è di ridurre il numero dei pesci utilizzati per il monitoraggio sanitario e per ottimizzare il fatturato, costo e la sensibilità della rilevazione. Tali metodi sono un’alternativa all’uso di animali e alcune tecniche possono essere applicate alle importazioni di screening in quarantena. Ad esempio, Mocho9 era in grado di identificare altre specie micobatteriche patogene eseguendo PCR su tamponi di pozzetto anziché su zebrafish (tra cui sentinelle), e questo è stato ottenuto con un minor numero di campioni. In quanto stesso studio, p. tomentosa uova sono state rilevate con più sensibilità schermando i fanghi di serbatoio mediante flottazione e microscopia elettronica piuttosto che test pesce mediante PCR e l’istopatologia.
La tabella 1 riassume le varie caratteristiche di sentinella programmi3,4,5,6,7,8,9,10 utilizzato da un numero di strutture di zebrafish. Post-filtrazione sentinelle ricevono acqua nello stesso modo come qualsiasi pesce di Colonia, mentre pre-filtrazione sentinelle ricevono l’acqua una volta che ha fatto circolare attraverso vasche di pesci di Colonia in primo luogo. Ad esempio, sentinelle di pre-filtrazione possono essere impostare il sistema di ricircolo continuamente ricevendo acqua del pozzetto. Questo non può essere un’opzione quando ci sono molti sistemi indipendenti in una stanza. In questo caso, un carro armato di pre-filtrazione sentinelle consente di schermare l’intera stanza. Le sentinelle sono in un serbatoio statico, il sistema di ricircolo, e l’acqua viene cambiata regolarmente, usando solo pre-filtrazione acqua cioè, acqua del pozzetto da tutti i sistemi in camera. Questa tecnica è descritta qui di seguito come base per il confronto con l’efficacia dello screening ambientale. L’allestimento proposto è progettato per controllare i problemi di qualità di acqua come una diminuzione del pH o un inquinamento di azoto.
Il concetto dello screening ambientale batterico si basa sull’ipotesi che i batteri sono rilevabili nel biofilm come quello trovato sul muro pozzetto alla superficie dell’acqua o nel fango nella parte inferiore di un carro armato. Il pozzetto sembra un punto di campionamento ideale in un sistema di ricircolo acquacoltura poiché raccoglie rifiuti (acqua, feci, mangimi e altro materiale organico) da tutti i serbatoi pre-filtrazione. La superficie del pozzetto è spesso facilmente raggiungibile, la scovolatura è veloce e può essere eseguita in modo asettico per evitare la contaminazione del campione (da guanti per esempio). Il concetto viene utilizzato per identificare spp Mycobacterium patogeno prevalente in zebrafish sistemi9,12. La tecnica è descritta di seguito e anche stiamo segnalando rilevazione di a. hydrophila in zebrafish pozzetto tamponi superficiali e fanghi.
Lo screening ambientale per uova di parassiti è basato sulla rilevazione di Murray et al. 13 e la tecnica di galleggiamento è usato ordinariamente per Parassitologia e screening microscopico di uova di parassiti nelle feci14. Mocho9 proposto un’alternativa al processo di campionamento e ha mostrato che la tecnica potrebbe essere usata per rilevare altre specie del biotopo pesce. Infetti d. rerio passare p. tomentosa uova con le feci e le uova del parassita rimangono nella parte inferiore del serbatoio, nel fango. Ci possono essere raccolti a causa della loro densità maggiore di acqua. La densità delle uova viene utilizzata per elaborare il campione ambientale troppo. Un primo flottazione con centrifugazione separa acqua e detriti leggeri dalla materia più pesante. Una seconda centrifugazione si basa sulla soluzione di zucchero saturo (con una densità maggiore densità delle uova di p. tomentosa ) per consentire le uova del parassita ad emergere sulla superficie del tubo.
Lo screening per i batteri nel biofilm e per p. tomentosa dalla parte inferiore del serbatoio possa essere combinato mediante l’esecuzione di PCR per tutti questi agenti patogeni sul sedimento del campione dei fanghi ottenuti dopo la centrifugazione prima. Ciò consente di ottimizzare il tempo di campionamento. Il metodo è descritto di seguito. Proponiamo inoltre di utilizzare queste tecniche in un contesto di quarantena. Per schermare importati zebrafish adulto che hanno bisogno di essere mantenuto in vita, viene inserito un dispositivo di allevamento alla vasca di quarantena. Dopo una settimana, le feci e altri materiali di scarto nel dispositivo allevamento vengono raccolti e schermati da microscopia o PCR. La tecnica è descritta di seguito e alcune uova di p. tomentosa sono stati rilevati da microscopia in questo contesto.
Limitazioni delle tecniche, passaggi critici e risoluzione dei problemi:
L’età, genere, deformazione e lunghezza di esposizione delle sentinelle non sono standardizzati. Questo è mostrato nella tabella 1. C’è molto poco screening di pesce inferiore a 6 mesi di età, o di pesce invecchiato. Ci possono essere alcuni agenti patogeni che colpiscono i pesci giovani, come ci sono alcuni agenti patogeni che sono più prevalenti nei più anziani della popolazione10,18,19,20. Allo stesso modo, il sesso non è considerato nella selezione di alcuni gruppi di sentinella nonostante qualche relazione che c’è un pregiudizio di genere per alcuni agenti patogeni21. La tecnica proposta cerca di affrontare questi problemi, anche se la scelta del ceppo ha potuto essere fatto secondo un patogeno specifico per monitorare. Ad esempio, TU potrebbe aiutare con il rilevamento di Mycobacterium spp.12,22, ma c’è il rischio che le sentinelle fungerebbe quindi da un serbatoio o display segni clinici. Per quanto riguarda la durata dell’esposizione, l’approccio di Zebrafish International Resource Center10 aumenta le possibilità di rilevare gli agenti patogeni che potrebbero sfuggire con un periodo di contaminazione inadeguata. La necessità di un’esposizione prolungata implica che le sentinelle non sono prontamente disponibili. L’aggiunta dei campioni ambientali permette una certa flessibilità e la moltiplicazione degli eventi lo screening. Per esempio, campionamento può avvenire ogni mese con un intervallo di 4 mesi tra ogni metodo di screening. Questo può ridurre il lasso di tempo prima che un agente patogeno recentemente introdotto viene rilevato.
Le tecniche di selezione ambientale si basano sulla rilevazione degli agenti patogeni nell’ambiente. Gli agenti patogeni sono versati dai pesci e quindi diluiti in acqua dell’impianto. Non è stata esplorata la possibilità di catturare gli agenti patogeni da acqua filtrazione23 . I metodi che descriviamo sono efficaci solo se gli agenti patogeni sono dato abbastanza tempo di moltiplicarsi in pesce e biofilm per raggiungere una soglia di contaminazione che permettono la rilevazione. Questa limitazione delle tecniche è ridotta a icona di una selezione critica dei siti di campionamento: il fango nel serbatoio viene campionato piuttosto che i fanghi di pozzetto, e l’acqua e il biofilm sono campionati alla superficie del pozzetto, piuttosto che in un serbatoio o una post-filtrazione. Tuttavia, non tutti i campioni dallo stesso sistema rischiano di dare gli stessi risultati. Risultati positivi per p. tomentosa possono essere confermati mediante un altro test (istopatologia, PCR o analisi dei fanghi). Micobatterici risultati positivi di PCR possono essere confermati da coltura o da un altro laboratorio diagnostico. Tuttavia, quando si stabilisce uno stato di salute, ulteriori campioni sono raccomandati per confermare i risultati negativi da qualsiasi tecnica di screening ambientale.
Significato della tecnica rispetto ai metodi esistenti/Alternative:
Mycobacterium spp sono comuni nell’ambiente e la loro presenza nel pozzetto non predice la loro patogenicità12. Mocho9 hanno mostrato che i tassi di mortalità di monitoraggio è la chiave per sorvegliare gli sviluppi di problemi di salute. L’uso di campioni animali rimane essenziale per qualsiasi indagine veterinaria. Monitoraggio dello stato implica il rilevamento di tutti gli agenti patogeni prevalenti in una struttura e questo non può essere realizzato con l’uso esclusivo di tecniche di screening ambientale. Tuttavia, una mancanza di sensibilità degli strumenti di diagnosi può ritardare o impedire un’accurata descrizione dello stato di salute. Mentre l’uso di sentinelle riduce il numero di pesci richiesto per rilevare un microbo prevalente nella popolazione, la mancanza di sensibilità aggiunge peso alla utilizzando una combinazione di metodi, tra cui selezione ambientale5,23. Infatti allo status specifico patogeno libero è solitamente definito come l’assenza di una specie nella struttura tale che campioni ambientali e animali devono prova negativa24,25.
I risultati del tampone di pozzetto per identificare Mycobacterium spp. dimostrano che affidarsi a pesce campioni possono condurre ad uno stato di falsi negativi per la salute. 6 specie micobatteriche testate sono descritti come patogeni o potenziale patogeno in zebrafish15 e alcuni non avrebbe eliminato di disinfezione delle superfici uovo con cloro26 effettuati come ordinariamente in quarantena. Di conseguenza, il falso negativo può avere alcune conseguenze per collaboratori che linee di importazione. Ad esempio, M. fortuitum è stato perso dalla PCR sul campione di pesce, ma più della metà del tampone pozzetto PCR ha rilevato. Considerando che questi micobatteri sono più resistenti al cloro rispetto ad altri e la loro capacità di crescere nell’ acqua sistemi27, è un rischio per l’impianto di importazione non contaminati. Per consentire l’importazione di linee, i gestori devono fidarsi e confrontare i rapporti di salute della struttura esportatore con loro. Il programma di valutazione delle prestazioni ICLAS28 è la chiave per quel processo in roditori. La rete RESAMA segnala l’individuazione di gordonae del M. e M. mucogenicum in francese d. rerio11. Questi micobatteri non sono proposte nei pannelli dei laboratori commerciali che utilizziamo. Sarebbe utile per estendere il programma ICLAS e ad armonizzare i saggi diagnostici, nonché l’elenco delle specie patogene29.
A. hydrophila è anche un agente patogeno che ha il potenziale per essere introdotti durante l’importazione di animali, anche se la sua suscettibilità a cloro30 rende più probabile la sua eliminazione durante la disinfezione delle superfici uovo routine. Il pozzetto, tampone e fanghi risultati mostrano che lo screening ambientale può essere usato per rilevare questo agente patogeno. Altri batteri come Mycobacterium spp sono stati rilevati in fanghi da PCR23. Questo tipo di campione è particolarmente rilevante poiché consente il rilevamento degli agenti patogeni capannone. Ad esempio, un’altra nuova applicazione è l’analisi dei fanghi allo schermo pesce importato in quarantena per p. tomentosa. Il parassita è una minaccia per la salute13 e neoplasia modelli16 dell’animale. Inoltre, le concentrazioni di cloro utilizzate nella disinfezione delle superfici di routine zebrafish uovo non sono efficienti31. Di conseguenza, la possibilità di schermare gli animali importati con un fatturato di una settimana e senza qualsiasi eutanasia di pesce sembra molto attraente. Questa tecnica può influenzare le regole di quarantena e biosicurezza consentendo un triage delle importazioni. Un processo decisionale è quindi progettato secondo i patogeni prevalenti nella struttura esportatore, i patogeni rilevati nei campioni dal pesce importato e il rischio di compromettere lo stato di salute dell’importazione struttura10.
Applicazioni future o indicazioni dopo la padronanza di queste tecniche:
Anche se il trattamento di routine quarantena è l’opzione scelta, l’efficacia di tale farmaco32,33,34,35,36 può essere valutata con l’analisi di fanghi dispositivo di allevamento. Più in generale, lo screening ambientale poteva essere utilizzato per testare composti contro batteri e parassiti eradicazione, tra cui il biotopo di pesce. Un’altra applicazione di nicchia dello screening ambientale è quello di monitorare la popolazione dell’agente patogeno nel live feed37,38. Se l’applicazione principale di queste tecniche è come una preziosa aggiunta alla casella degli strumenti di diagnosi per il monitoraggio in zebrafish strutture dello stato. Grazie ad una più accurata, costo e tempo efficiente definizione dello stato di salute, tamponi di pozzetto e analisi dei fanghi sono complementari per la sorveglianza sentinella e la pratica di routine quarantena. Infatti, il futuro di queste tecniche è quello di essere una parte sistematica di qualsiasi rapporto di salute del laboratorio acquatico.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori vorrei ringraziare il team di BRF Aquatics del Francis Crick Institute per l’aiuto tecnico e il contributo critico. Questo lavoro è stato supportato dall’Istituto Francis Crick che riceve il finanziamento di base da Cancer Research UK (FC001999), UK Medical Research Council (FC001999) e il Wellcome Trust (FC001999).
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