Dit protocol beschrijft het gebruik van sump swabs en slib analyse van zebravis systemen, die tot verhoogde detectie in vergelijking met het exclusieve gebruik van sentinels leidt te detecteren ziekteverwekkers zoals Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. en Pseudocapillaria tomentosa. Een systeem om te controleren van P. tomentosa eieren in quarantaine wordt ook voorgesteld.
Gezondheid monitoring systemen worden ontwikkeld en gebruikt in zebrafish onderzoeksfaciliteiten, omdat ziekteverwekkers van Danio rerio zoals Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. en Pseudocapillaria tomentosa het potentieel om te hebben afbreuk doen aan het welzijn van dieren en onderzoek. De vissen zijn meestal geanalyseerde post-mortem te detecteren van microben. Het gebruik van verklikkerdieren is een voorgestelde manier om de gevoeligheid van het toezicht op en te verminderen van het aantal dieren om te proeven. De instelling van een tank pre filtratie sentinel uit een recirculatie systeem wordt beschreven. De techniek is ontwikkeld ter voorkoming van waterverontreiniging en de vis bevolking vertegenwoordigen door een zorgvuldige selectie van leeftijd, geslacht en stammen. Om te gebruiken het minimumaantal dieren, zijn de technieken om het scherm van het milieu ook gedetailleerd. Polymerase Chain Reaction (PCR) op oppervlakte sump swabs wordt gebruikt voor een aanzienlijke verbetering van de opsporing van een aantal bekende en pathogene mycobacteriële soorten zoals Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium haemophilumen Mycobacterium chelonae. Een ander milieu methode bestaat uit het verwerken van het slib op de bodem van een holdingstank of Opvangbakken op zoek naar P. tomentosa eieren. Dit is een goedkope en snelle techniek die kan worden toegepast in quarantaine waar een fok-apparaat is ondergedompeld in de holdingstank van geïmporteerde dieren. Ten slotte, PCR wordt toegepast op het slib monster en A. hydrophila wordt aangetroffen op de bodem en de oppervlakte van het Carter. In het algemeen, deze milieu screening technieken toegepast op deze specifieke ziekteverwekkers hebben geleid tot een verhoogde gevoeligheid ten opzichte van het testen van pre filtratie sentinels.
Ter bescherming van onderzoek en het welzijn van dieren1,2, is de aanwezigheid van ziekteverwekkers dierlijke voorzieningen bewaakt. In het geval van zebravis, gezondheidsmonitoring3,4,5,6,7,8,9,10,11 is vaak gebaseerd op dieren geanalyseerd postmortaal histopathologisch onderzoek, Bacteriologie cultuur of moleculaire methoden. Testen alleen kolonie dieren is niet de aanbevolen methode vanwege het aantal vissen en verwante lasten die nodig zou zijn om het opsporen van ziekteverwekkers van lage prevalentie. Daarom is de voorkeursmethode bloot van een kleine groep van dieren met een hogere belasting van verontreinigingen. Deze vissen heten pre filtratie sentinels. Deze blootstelling duurt maanden en het gaat om een toename van de werklast van de dierlijke verzorger en/of sommige speciaal gebouwde oplossing voor procestechniek. Een andere uitdaging is de screening van geïmporteerde lijnen in quarantaine waar de vruchtbare dieren zijn leven wordt gehouden, en dit is niet compatibel met routinematige testen op karkassen.
Hier beschrijven we enkele methoden voor het detecteren van bepaalde ziekteverwekkers van de zebravis (A. hydrophila, Mycobacterium spp., en P. tomentosa) door screening van het aquatische systeem omgeving. Het doel is om het aantal vissen gebruikt voor gezondheidsmonitoring en voor het optimaliseren van de omzet, de kosten en de gevoeligheid van de detectie. Dergelijke methoden zijn een alternatief voor het gebruik van dieren en sommige technieken kunnen worden toegepast op de screening invoer in quarantaine. Bijvoorbeeld, Mocho9 was in staat om meer pathogene mycobacteriële soorten identificeren door het uitvoeren van PCR op sump swabs in plaats van op zebrafish (inclusief sentinels), en dit werd verkregen met minder monsters. In die zin dat dezelfde studie, P. tomentosa eieren werden ontdekt met meer gevoeligheid door screening van het slib van de tank met behulp van reserve-drijfvermogen en microscopie in plaats van testen van vis door PCR en histopathologisch onderzoek.
Tabel 1 geeft een overzicht van de verschillende kenmerken van sentinel programma’s3,4,5,6,7,8,9,10 door een aantal zebrafish faciliteiten gebruikt. Na filtratie sentinels ontvangen water op dezelfde manier als een kolonie vis, terwijl pre filtratie sentinels water ontvangen zodra het heeft verspreid via kolonie vissentanks eerst. Bijvoorbeeld, kunnen pre filtratie sentinels worden instellen op de recirculatie systeem door continu ontvangen sump water. Dit is niet een optie wanneer er veel onafhankelijke systemen op één kamer zijn. In dit geval kan een tank van pre filtratie sentinels worden gebruikt op het scherm de hele kamer. De sentinels zijn in een statische tank, uit de recirculatie systeem, en hun water regelmatig wordt gewijzigd met behulp van alleen pre filtratie water dat wil zeggen, sump water uit alle systemen op de kamer. Deze techniek wordt beschreven hieronder als een basis voor vergelijking met de werkzaamheid van de milieu-screening. De voorgestelde structuur is ontworpen om de water kwaliteit controlekwesties zoals een daling van de pH of de vervuiling van een stikstof.
Het concept van de bacteriële milieu screening is gebaseerd op de hypothese dat bacteriën opspoorbaar in de biofilm zoals die gevonden op de muur van de Carter van het wateroppervlak of in het slib op de bodem van een tank zijn. Het Carter lijkt een ideale monsterpunt in een recirculatie aquacultuur systeem omdat zij afval (water, ontlasting, diervoeders en andere organisch materiaal verzamelt) van alle tanks pre filtratie. Het oppervlak van het Carter is vaak gemakkelijk bereikbaar, het zwabberen is snel, en het aseptisch Voorkom kruisbesmetting van het monster (van handschoenen bijvoorbeeld) kan worden uitgevoerd. Het concept wordt gebruikt voor het identificeren van overwegend pathogene Mycobacterium spp. in zebrafish systemen9,12. De techniek wordt hieronder beschreven en we zijn ook rapportage detectie van A. hydrophila in zebrafish sump oppervlakte swabs en slib.
De milieu screening voor eieren van de parasiet is gebaseerd op de detectie van Murray et al. 13 en de flotatie-techniek wordt regelmatig gebruikt voor Parasitologie en microscopische screening van eitjes van de parasiet in ontlasting14. Mocho9 voorgesteld alternatief aan het proces van de bemonstering en bleek dat de techniek kan worden gebruikt voor het detecteren van andere soorten van de biotoop van de vis. Geïnfecteerde D. rerio pass P. tomentosa eieren met hun ontlasting en de eitjes van de parasiet blijven op de bodem van de tank, in het slib. Kunnen zij verzamelde er als gevolg van hun dichtheid dat breder is dan water. De dichtheid van de eieren is gebruikt voor het verwerken van het milieu monster ook. Water en licht puin zijn gescheiden van zwaardere kwestie een eerste flotatie met centrifugeren. Een tweede centrifugeren berust op verzadigde suikeroplossing (met een dichtheid groter is dan de dichtheid van P. tomentosa eieren) zodat de eitjes van de parasiet te ontstaan aan het oppervlak van de buis.
De screening voor bacteriën in de biofilm en P. tomentosa vanaf de onderkant van de tank kan worden gecombineerd door het uitvoeren van PCR voor alle deze ziekteverwekkers op het slib monster sediment verkregen na de eerste centrifugeren. Dit optimaliseert het bemonsteringstijdstip. De methode wordt hieronder beschreven. Ook stellen wij voor om het gebruik van deze technieken in de context van een quarantaine. Naar screen geïmporteerde volwassen zebrafish moeten leven wordt gehouden, wordt een fok-apparaat ingevoegd in de quarantaine-tank. Na een week, worden ontlasting en andere afvalstoffen in de fokkerij-apparaat verzameld en gescreend door microscopie of PCR. De techniek wordt hieronder beschreven en sommige P. tomentosa eieren werden ontdekt door microscopie in dit verband.
Beperkingen van de technieken, kritische stappen, en probleemoplossing:
De leeftijd, het geslacht, de stam en de duur van blootstelling van de sentinels zijn niet gestandaardiseerd. Dit is weergegeven in tabel 1. Er is zeer weinig screening van vis onder de 6 maanden van leeftijd of leeftijd vis. Er kunnen sommige ziekteverwekkers die invloed hebben op de jonge vis aangezien er sommige ziekteverwekkers die vaker in de oudere bevolking10,18,19,20. Ook het geslacht wordt niet beschouwd als in de selectie van sommige groepen van de sentinel ondanks sommige verslag dat er een gender bias voor sommige ziekteverwekkers21is. De voorgestelde techniek probeert deze kwesties, hoewel de keuze van de stam kon worden gemaakt volgens een bepaalde ziekteverwekker te controleren. Bijvoorbeeld, TU zou kunnen helpen met de detectie van Mycobacterium spp.12,22, maar er is een risico dat de sentinels vervolgens als een reservoir of beeldscherm klinische symptomen fungeren zou. Met betrekking tot de duur van de blootstelling verhoogt de aanpak van de zebravis International Resource Center10 de kans op te sporen van ziekteverwekkers die met een ontoereikende besmetting periode kon worden gemist. De behoefte aan langdurige blootstelling impliceert dat sentinels niet dadelijk beschikbaar zijn. De toevoeging van de milieu monsters kan enige flexibiliteit en de vermenigvuldiging van de screening evenementen. Bijvoorbeeld, kan bemonstering plaatsvinden om de andere maand met een 4 maand interval tussen elke screeningmethode. Hierdoor kan het verstrijken van de tijd voordat een nieuw geïntroduceerde pathogeen wordt ontdekt.
De screening van de milieu-technieken, is afhankelijk van de opsporing van ziekteverwekkers in het milieu. De ziekteverwekkers zijn vergoten door de vissen en daarom in het systeem water verdund. De mogelijkheid van het vastleggen van de ziekteverwekkers door water filtratie23 werd niet onderzocht. De methoden die we beschrijven zijn alleen effectief als pathogenen genoeg tijd krijgen zijn om zich te vermenigvuldigen in vis en biofilm te bereiken van een drempel van verontreiniging waardoor detectie. Deze beperking van de technieken is geminimaliseerd door een kritische selectie van de bemonstering sites: het slib in de tank in plaats van het Carter slib wordt bemonsterd, en het water en de biofilm worden bemonsterd op het oppervlak van het Carter in plaats van in een tank of na filtratie. Alle monsters van hetzelfde systeem is echter onwaarschijnlijk dat hetzelfde resultaat opleveren. Positieve resultaten voor P. tomentosa kunnen worden bevestigd met behulp van een andere bepaling (Histopathologie, PCR of slib analyse). Mycobacteriële PCR positieve resultaten kunnen per cultuur of door een ander diagnostisch laboratorium worden bevestigd. Echter, bij de vaststelling van een gezondheidsstatus, verdere monsters worden aanbevolen negatieve resultaten van eventuele milieu screening techniek te bevestigen.
Betekenis van de techniek met de betrekking tot bestaande/alternatieve methoden:
Mycobacterium spp. zijn gebruikelijk in het milieu en hun aanwezigheid in het Carter doet niet voorspellen hun pathogeniteit12. Mocho9 bleek dat monitoring sterftecijfers is de sleutel tot het onderzoek van de ontwikkelingen van gezondheidskwesties. Het gebruik van dierlijke monsters blijft van essentieel belang om een veterinair onderzoek. Detectie van alle voorkomende ziekteverwekkers in een faciliteit gezondheidsmonitoring impliceert en dat lukt niet met het exclusieve gebruik van milieu screening technieken. Niettemin, is een gebrek aan gevoeligheid van de diagnostische hulpprogramma’s kan vertragen of te verhinderen een nauwkeurige beschrijving van de gezondheidstoestand. Terwijl het gebruik van verklikkerdieren het aantal vissen nodig vermindert voor de detectie van een overwegend microbe in de bevolking, voegt het gebrek aan gevoeligheid gewicht aan het gebruik van een combinatie van methoden, met inbegrip van milieu screening5,23. Inderdaad wordt de specifieke pathogene vrije status meestal gedefinieerd als de afwezigheid van een soort in de faciliteit zodanig dat milieu en dier monsters negatief24,25 testen moeten.
De sump wattenstokje resultaten te identificeren Mycobacterium spp. tonen aan dat vertrouwen op vis monsters tot een vals negatieve gezondheidsstatus hebben leiden kunnen. De 6 geteste mycobacteriële soorten worden beschreven als pathogene of potentieel pathogene in zebrafish15 en sommige zou niet worden opgeheven door ei oppervlakte desinfectie met chloor26 als routinematig uitgevoerd in quarantaine. Daarom kan de valse negatieve gevolgen hebben sommige voor medewerkers die regels importeren. Bijvoorbeeld, M. fortuitum werd gemist door de PCR op vis monster, maar meer dan de helft van het Carter staafje PCR speurder op. Gezien het feit dat deze mycobacteriën meer resistent zijn tegen chloor dan anderen en hun vermogen om te groeien in de watersystemen27, is het een risico voor de niet-verontreinigde importerende faciliteit. Als u wilt dat de invoer van lijnen, moeten managers vertrouwen en de verslagen van de gezondheid van de exporterende faciliteit met hunne vergelijken. De ICLAS Performance evaluatie programma28 is de sleutel tot dit proces in knaagdieren. Het netwerk van RESAMA meldt de detectie van M. gordonae en M. mucogenicum in Franse D. rerio11. Deze mycobacteriën niet worden voorgesteld in de panelen van de commerciële laboratoria die we gebruiken. Het zou zinvol zijn om uit te breiden het programma ICLAS en harmonisatie van de diagnostische tests, alsmede de lijst van pathogene soorten29.
A. hydrophila is ook een ziekteverwekker die het potentieel heeft om te worden ingevoerd bij de invoer van dieren, hoewel de gevoeligheid voor chloor30 de afschaffing waarschijnlijker tijdens routinematige ei oppervlakte ontsmetting maakt. De Carter, zwabber en slib resultaten tonen dat milieu screening kan worden gebruikt voor het detecteren van deze pathogenen. Andere bacteriën zoals Mycobacterium spp. zijn opgetreden in het slib door PCR23. Dit soort monster is bijzonder relevant, aangezien hierdoor de opsporing van ziekteverwekkers van de schuur. Een andere nieuwe toepassing is bijvoorbeeld de analyse van slib te screenen van geïmporteerde vis in quarantaine voor P. tomentosa. De parasiet is een bedreiging voor dierlijke gezondheid13 en neoplasie modellen16. Bovendien zijn gebruikte in routine zebrafish ei oppervlakte ontsmetting van chloor-concentraties niet efficiënt31. De mogelijkheid om het scherm van de ingevoerde dieren met een omzet van één week en zonder enige vis euthanasie lijkt daarom zeer aantrekkelijk. Deze techniek kan de quarantaine en bioveiligheid regels beïnvloeden doordat een triage van invoer. Een besluitvormingsproces is ontworpen volgens de bekende pathogenen in de exporterende faciliteit, de gedetecteerde pathogenen in de monsters van de geïmporteerde vis, en het risico van de gezondheidstoestand van de importerende faciliteit10in gevaar te brengen.
Toekomstige toepassingen of richtingen na het beheersen van deze technieken:
Zelfs als routine quarantaine behandeling de gekozen optie is, kan de werkzaamheid van zulke medicijnen32,33,34,35,,36 worden beoordeeld met de fok apparaat slib analyse. Meer in het algemeen, de milieu-screening kan worden gebruikt voor het testen van verbindingen tegen bacteriën en parasiet uitroeiing, met inbegrip van in de vis-biotoop. Een andere niche toepassing van de milieu-screening is het monitoren van de pathogeen-bevolking in de live feed37,,38. Hoewel de belangrijkste toepassing van deze technieken als een waardevolle toevoeging aan de diagnose werkset voor de gezondheidsmonitoring in zebrafish faciliteiten is. Dankzij een nauwkeuriger, kosten en tijd efficiënt definitie van de gezondheidstoestand, sump swabs en slib analyse zijn complementair aan de bewaking van de sentinel en de praktijk routine quarantaine. Inderdaad, de toekomst van deze technieken is als een routine onderdeel van alle aquatische laboratoriumrapport voor de gezondheid.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedank het BRF zwemmen team van het Francis Crick Instituut voor hun technische hulp en kritische input. Dit werk werd gesteund door het Francis Crick Instituut die ontvangt de basisfinanciering van het Cancer Research UK (FC001999), de Britse Medical Research Council (FC001999) en de Wellcome Trust (FC001999).
Aqua-Sed 250 mL | Vetark | 2-phenoxyethanol | |
Tubed Sterile Dryswab Tip | mwe | MW100 | Sump surface |
BD Plastipak Disposable Syringe 50mL Eccentric | Becton Dickinson |
300866 | They are actually graduated to 60 ml |
Centrifuge tube 15 mL Corning | Corning | 430766 | |
Centaur 2 benchtop centrifuge with 4 x 200 mL Swing–Out Rotor (unsealed) | Sanyo | MSB020.CX1.5 | |
Cover Glass 22 mm x22 mm | Menzel-Glaser | MNJ-350-020H | |
Plain Swab Sterile Plastic Applicator Rayon Tipped White Cap | Sterilin Ltd Thermo Fisher Scientific | F155CA | Swab sediment from sludge |
50 mL Self-Standing Centrifuge Tube CentriStar Cap | Corning | 430921 | |
In-Tank Spawning Tray Set | MBK Installations Ltd |