פרוטוקול זה מתאר את השימוש sump מטליות וניתוח בוצה של דג זברה מערכות, מה שמוביל גילוי מוגברת בהשוואה לשימוש הבלעדי של זקיפים לזהות פתוגנים כגון Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. Pseudocapillaria tomentosa. מערכת לפקח tomentosa פ ביצים בהסגר גם מוצע.
מערכות ניטור הבריאות הם שפותחו ונמצאות בשימוש במתקנים מחקר דג זברה מפני פתוגנים של רזבורה rerio כגון Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. Pseudocapillaria tomentosa יש פוטנציאל לפגום רווחת ומחקר. הדגים הם בדרך כלל שנותחה אחרי המוות כדי לזהות חיידקים. השימוש של זקיפים היא דרך המוצע כדי לשפר את רמת הרגישות של המעקב וכדי להפחית את מספר בעלי חיים כדי לטעום. ההגדרה של מיכל סינון מקדים סנטינל מהמערכת recirculating מתואר. הטכניקה מפותחת כדי למנוע זיהום מים וכדי לייצג את אוכלוסיית הדגים על-ידי בחירה זהירה של גיל, מגדר, זנים. על מנת להשתמש המספר המינימלי של חיות, מפורטים גם טכניקות למסך את הסביבה. תגובת שרשרת פולימראז (PCR) על משטח sump מטליות משמש לשפר באופן משמעותי את הגילוי של כמה מינים mycobacterial שכיחה פתוגניים כגון Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium haemophilumו- Mycobacterium chelonae. בשיטה סביבתית אחרת כוללת עיבוד של בוצה בחלק התחתון של מיכל או בור קיבול לחפש ביצים tomentosa פ . זוהי טכניקה זול ומהיר שניתן להחיל בהסגר איפה מכשיר הרבייה שקוע לתוך המיכל של בעלי חיים מיובאים. לבסוף, PCR מוחל על המדגם בוצה, hydrophila א ומתגלה של הניקוז התחתון ועל פני השטח. באופן כללי, טכניקות ההקרנה סביבתיים אלה שהוחל פתוגנים ספציפיים אלה הובילו רגישות מוגברת בהשוואה בדיקה של זקיפים סינון מקדים.
על מנת להגן על מחקר, רווחת בעלי חיים1,2, הנוכחות של פתוגנים מנוטר בתוך מתקנים בעלי חיים. במקרה של דג זברה, לבריאות ניטור3,4,5,6,7,8,9,10,11 מסתמך על חיות ניתוח לאחר המוות histopathology, בקטריולוגיה תרבות או שיטות מולקולריות לעתים קרובות. בדיקות רק המושבה חיות אינה השיטה המומלצת בגלל המספר של דגים והוצאות נלוות הנדרשים כדי לזהות פתוגנים של שכיחות נמוכה. לכן, השיטה המועדפת היא לחשוף קבוצה קטנה של בעלי חיים כדי עומס גבוה יותר של מזהמים. דגים אלה נקראים סינון מקדים זקיפים. חשיפה זו נמשך כבר חודשים, זה כרוכה בהגברת עומס העבודה של המטפלים בבעלי חיים ו/או פתרון הנדסי בנוי למטרה. אתגר נוסף הוא ההקרנה של קווי מיובאים בהסגר שהחיות פורייה להשאירו בחיים ואיפה זה אינה תואמת מבחני שגרתית על הגוויות.
נתאר כאן כמה שיטות לזהות פתוגנים דג זברה מסוימת (hydrophila א, Mycobacterium spp., ו פ tomentosa) על-ידי הקרנת הסביבה הימית של המערכת. המטרה היא להפחית את מספר הדגים המשמש לניטור תקינות וכדי לייעל את מחזור, עלות, ורגישות של הזיהוי. שיטות כאלה הם אלטרנטיבה השימוש בבעלי חיים, ניתן ליישם כמה טכניקות ההקרנה יבוא בבידוד. לדוגמה, Mocho9 הצליח לזהות יותר מינים mycobacterial פתוגניים על-ידי ביצוע PCR sump מטליות ולא על דג זברה (כולל זקיפים), זה היה מתקבל עם דוגמאות פחות. כי אותו ללמוד, ביצים tomentosa פ זוהו עם רגישות רבה יותר על-ידי הקרנת הבוצה את הטנק באמצעות הנפקה ומיקרוסקופיה במקום בדיקות דגים על ידי ה-PCR ו- histopathology.
טבלה 1 מסכמת את המאפיינים השונים של הפלאג תוכניות3,4,5,6,7,8,9,10 בשימוש על ידי מספר מתקנים דג זברה. לאחר סינון זקיפים מקבלות מים באותו אופן כמו דגים המושבה ואילו זקיפים סינון מקדים לקבל מים ברגע זה יש שהופץ דרך מיכלי דגים המושבה הראשונה. לדוגמה, סינון מקדים זקיפים ניתן להגדיר במערכת recirculating על-ידי ללא הרף קבלת בור קיבול מים. לא ייתכן אופציה כאשר ישנן מערכות עצמאיות רבות בחדר אחד. במקרה זה, טנק אחד של זקיפים סינון מקדים יכול לשמש כדי לסנן את כל החדר. שהזקיפים במיכל סטטי, מחוץ למערכת recirculating, המים שלהם משתנה באופן קבוע, באמצעות סינון מים, רק קרי, בור קיבול המים של כל המערכות בחדר. טכניקה זו היא כמפורט להלן כקו להשוואה עם היעילות של ההקרנה סביבתיים. הסידור המוצע נועד לשלוט בבעיות איכות מים כמו ירידה של pH או זיהום חנקן.
הרעיון של ההקרנה סביבתיים חיידקי מסתמך על ההנחה כי חיידקים הם לזיהוי biofilm כגון אלה שנמצאו על הקיר sump על פני המים או את כל הטינופת בתחתית מיכל. הניקוז נראה נקודת דגימה אידיאלי במערכת חקלאות ימית recirculating מאז שהיא אוספת פסולת (מים, צואה, הזנה, וחומר אורגני אחר) מתוך כל מיכלי סינון. השטח של הניקוז לעיתים קרובות נגיש בקלות, מקימה זה מהר, זה יכול להתבצע גילוח ורחיצה כירורגית למניעת זיהום צולב של המדגם (מתוך כפפות לדוגמה). המושג משמש לזיהוי ונפוצים פתוגניים Mycobacterium spp. דג זברה מערכות9,12. הטכניקה המתוארת להלן, אנחנו מדווחים גם על זיהוי של hydrophila א דג זברה sump משטח מטליות, בוצה.
ההקרנה סביבתי עבור טפיל ביצים המבוסס על הזיהוי על ידי מורי. et al. 13 ו הטכניקה הנפקה משמש באופן שגרתי עבור פרזיטולוגיה והקרנת מיקרוסקופיים טפיל ביצים צואה14. Mocho9 הציע אלטרנטיבה תהליך הדגימה, הראה כי הטכניקה יכול לשמש כדי לזהות מינים אחרים של ביוטופ דגים. נגוע rerio ד לעבור tomentosa פ ביצים עם הצואה שלהם ולהישאר ביצי הטפיל בתחתית המיכל, ב כל הטינופת. הם יכולים להיות שנאספו לשם עקב צפיפות שלהם יותר מים. הצפיפות של הביצים משמש לעיבוד המדגם סביבתיים מדי. הנפקה ראשונה עם צנטריפוגה מפריד מים ופסולת אור מחומר כבד יותר. צנטריפוגה השני מסתמך על פתרון סוכר רוויה (עם צפיפות גדול יותר צפיפות של ביצים פ tomentosa ) כדי לאפשר טפיל ביצים לצוץ על פני השטח של הצינור.
ניתן לשלב ההקרנה לחיידקים biofilm ועבור tomentosa פ מתחתית המיכל על ידי ביצוע PCR עבור כל הפתוגנים אלה על המשקע מדגם בוצה שהושג לאחר צנטריפוגה הראשון. הדבר מייעל את זמן הדגימה. השיטה המתוארת להלן. אנו גם מציעים להשתמש טכניקות אלה בהקשר הסגר. למסך מיובאים דג זברה למבוגרים צריך להשאר בחיים, מוכנס מכשיר הרבייה למיכל בידוד. אחרי שבוע אחד, צואה וחומרי פסולת אחרים במכשיר הרבייה נאספים וכוח הוקרן על ידי מיקרוסקופ או ה-PCR. הטכניקה המתוארת להלן, כמה ביצים tomentosa פ אותרו על ידי מיקרוסקופ בהקשר זה.
מגבלות של הטכניקות, שלבים קריטיים, לפתרון בעיות:
גיל, מגדר, זן, ואורך חשיפת שהזקיפים לא מתוקננים. זו מוצגת בטבלה 1. יש מעט מאוד הקרנת דגים מתחת 6 חודשים של גיל, או של דג בגילאי. ייתכנו כמה פתוגנים להשפיע על הדגים הצעירים כמו ישנם כמה גורמי מחלה נפוצים יותר מבוגר באוכלוסייה10,18,19,20. באופן דומה, המגדר אינו נחשב בבחירה של כמה קבוצות סנטינל למרות מסוימים מדווחים שישנה דעה קדומה מגדר עבור חלק פתוגנים21. הטכניקה המוצע מנסה לטפל בבעיות אלה, אף על פי הבחירה של המתח יכול להיעשות על פי. חיידק מסוים כדי לפקח. לדוגמה, TU יכול לעזור. עם זיהוי Mycobacterium spp.12,22, אך קיים סיכון שהזקיפים ואז לשמש מאגר או הצג סימנים קליניים. לגבי האורך של חשיפה, הגישה של מרכז המשאבים הבינלאומי דג זברה10 מגדיל את הסיכויים לגילוי פתוגנים שלא יכול להיות בעלי תקופת זיהום לקוי. הצורך של חשיפה ממושכת מרמז כי זקיפים אינם זמינים. התוספת של הדגימות סביבתיים מאפשר גמישות הכפלה של האירועים ההקרנה. לדוגמה, הדגימה יכול להתרחש אחת לחודש עם מרווח 4 חודש בין כל שיטת הקרנה. זה עשוי להפחית את לשגות של זמן לפני חיידק הציג לאחרונה מזוהה.
טכניקות ההקרנה סביבתיים להסתמך על הגילוי של פתוגנים בסביבה. פתוגנים לשפוך על ידי הדג, לכן מדולל במים המערכת. לא היה בחנו את האפשרות של לכידת פתוגנים על-ידי סינון מים23 . השיטות שאנו מתארים הם יעילה רק אם פתוגנים מקבלים מספיק זמן כדי להכפיל ב biofilm כדי להגיע לסף מסוים של זיהום המאפשר זיהוי ודגים. מגבלה זו של הטכניקות למינימלי בעקבות מבחר האתרים דגימה קריטית: כל הטינופת במיכל נדגמים במקום כל הטינופת בור קיבול, המים ואת biofilm שנדגמו בפני השטח של הניקוז במקום מיכל או שלאחר סינון. למרות זאת, כל דגימות מן באותה המערכת סביר לתת את אותן תוצאות. תוצאות חיוביות עבור tomentosa פ יכול להיות מאושרות על-ידי שימוש assay אחר (histopathology, PCR או ניתוח בוצה). יכול להיות אישרו mycobacterial PCR תוצאות חיוביות על ידי תרבות או מעבדות אבחון נוסף. עם זאת, בעת יצירת מצב בריאות, עוד יותר דגימות מומלץ לאשר תוצאות שליליות בכל טכניקה הקרנה סביבתיים.
המשמעות של הטכניקה לגבי שיטות קיימות/חלופית:
Mycobacterium spp. נפוצים בסביבה, נוכחותם הניקוז אינה מנבאת שלהם פתוגניות12. Mocho9 הראה כי פיקוח על שיעורי התמותה הוא מפתח סקר את ההתפתחויות של בעיות בריאות. השימוש בבעלי חיים דגימות נשאר חיוני כל חקירה וטרינרי. לניטור תקינות מרמז על גילוי של כל גורמי מחלה שכיחה במתקן, זה אינה יכולה להיות מושגת עם השימוש הבלעדי של טכניקות ההקרנה סביבתיים. עם זאת, חוסר הרגישות של כלי אבחון יכול לעכב או למנוע תיאור מדויק של מצב בריאותו. בזמן השימוש של זקיפים מפחיתה את מספר הדגים הדרוש לאיתור חיידק נפוץ בקרב האוכלוסייה, חוסר רגישות מוסיף משקל באמצעות שילוב של שיטות, כולל הקרנה סביבתי5,23. אכן מצב ספציפי פתוגן חינם בדרך כלל מוגדר העדר של זן במתקן כזה כי דגימות בעלי חיים ואיכות הסביבה חייב לבדוק שלילי24,25.
התוצאות ספוגית sump לזהות Mycobacterium spp. מראים כי הסתמכות על דגים דגימות עלול להוביל מצב בריאותיות שליליות כוזבות. המין mycobacterial נבדק 6 מתוארים כתוצאה פתוגניים או פוטנציאל החולני של דג זברה15 וכמה לא להיות חוסל על ידי חיטוי משטח ביצה עם כלור26 כמו שגרתי שבוצעה בבידוד. לכן, השלילית עשויות להיות כמה השלכות על משתפי לייבא שורות. לדוגמה, מ fortuitum היה פספס את ה-PCR על מדגם דגים אבל יותר ממחצית הדגימה sump PCR מגלים אותו. בהתחשב בכך כי mycobacteria אלה הם עמידים יותר בפני הכלור מאשר אחרים, היכולת שלהם לגדל מערכות המים27, זה סיכון עבור מתקן ייבוא שאינו נגוע. כדי לאפשר הייבוא של קווים, מנהלי צריכים לבטוח ולהשוות את הדוחות הבריאות המתקן ייצוא עם שלהם. תוכנית הערכת ביצועים ICLAS28 היא המפתח לתהליך הזה בחולדות. הרשת RESAMA דיווח על הגילוי של gordonae מ ו מ mucogenicum הצרפתית rerio ד11. Mycobacteria אלה מוצעים לא הפאנלים של המעבדות מסחריים בהם אנו משתמשים. זה יהיה שימושי כדי להרחיב את התוכנית ICLAS, הרמוניה מבחני אבחון, כמו גם את רשימת זנים פתוגניים29.
Hydrophila א הוא גם. חיידק בעל פוטנציאל להיות מוצג בעת ייבוא בעלי חיים, למרות הרגישות שלה כלור30 עושה לחיסולה סביר יותר במהלך חיטוי משטח ביצה שגרתית. בור קיבול, ספוגית ותוצאות בוצה מראים כי ההקרנה סביבתי יכול לשמש כדי לזהות את הפתוגן. חיידקים אחרים כמו Mycobacterium spp. זוהו ב כל הטינופת על ידי ה-PCR23. סוג זה של מדגם רלוונטי במיוחד שכן הוא מאפשר הזיהוי של המחסן פתוגנים. לדוגמה, יישום חדש נוסף הוא ניתוח בוצה על המסך דגים המיובאים בהסגר עבור tomentosa פ. הטפיל מהווה איום של חיה בריאות13 ו neoplasia מודלים16. יתר על כן, ריכוז כלור בשימוש שגרתי דג זברה ביצה חיטוי משטח אינם יעילים31. לכן, היכולת מסך החיות מיובאים עם מחזור שבוע וללא המתת חסד כל דג נראה מאוד אטרקטיבי. טכניקה זו יכול להשפיע את כללי ההסגר, biosecurity בכך שהוא מאפשר מיון ראשוני. אם היבוא. תהליך קבלת ההחלטות מיועדת מכן פתוגנים ונפוצים במתקן ייצוא, פתוגנים שאותרו בדגימות של הדג המיובא, ואת הסכנה של התפשרות על מצב בריאותו של מתקן ייבוא10.
יישומים עתידיים או כיוונים אחרי מאסטרינג טכניקות אלה:
גם אם טיפול שגרתי הסגר היא האפשרות שבחרת, היעילות של כזה תרופה32,33,34,35,36 יכול להידרש בניתוח בוצה התקן הרבייה. באופן כללי יותר, ההקרנה סביבתי יכול לשמש לבדיקת תרכובות נגד חיידקים, טפילים חיסול, כולל ביוטופ דגים. יישום אחר נישה של ההקרנה סביבתי היא לנטר האוכלוסייה הפתוגן חיה הזנה37,38. למרות היישום העיקרי של טכניקות אלה כמו תוספת רבת ערך הכלים אבחון לבריאות ניטור במתקני דג זברה. תודה עלות וזמן מדויק יותר, יעיל ההגדרה של מצב תקינות, מטליות sump וניתוח בוצה הם משלימים המעקב סנטינל ואת התרגול הסגר שגרתית. אכן, העתיד של טכניקות אלה הוא להיות חלק שגרתי של כל דוח המעבדה הימית בריאות.
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצה להודות לצוות BRF בשחייה במכון פרנסיס קריק שלהם לעזרה טכנית, הקלט הקריטי. עבודה זו נתמכה על ידי פרנסיס קריק המכון אשר מקבל את הליבה המימון מ לחקר הסרטן בבריטניה (FC001999), בבריטניה המועצה למחקר רפואי (FC001999) וטרסט (FC001999).
Aqua-Sed 250 mL | Vetark | 2-phenoxyethanol | |
Tubed Sterile Dryswab Tip | mwe | MW100 | Sump surface |
BD Plastipak Disposable Syringe 50mL Eccentric | Becton Dickinson |
300866 | They are actually graduated to 60 ml |
Centrifuge tube 15 mL Corning | Corning | 430766 | |
Centaur 2 benchtop centrifuge with 4 x 200 mL Swing–Out Rotor (unsealed) | Sanyo | MSB020.CX1.5 | |
Cover Glass 22 mm x22 mm | Menzel-Glaser | MNJ-350-020H | |
Plain Swab Sterile Plastic Applicator Rayon Tipped White Cap | Sterilin Ltd Thermo Fisher Scientific | F155CA | Swab sediment from sludge |
50 mL Self-Standing Centrifuge Tube CentriStar Cap | Corning | 430921 | |
In-Tank Spawning Tray Set | MBK Installations Ltd |