Summary

El uso de modelos de pez cebra de Infecciones por Virus de la Influenza Humana A a la pantalla medicamentos antivirales y caracterizar inmune del huésped respuestas de las células

Published: January 20, 2017
doi:

Summary

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

Abstract

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Introduction

De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS), virus de la gripe infectan a un 5-10% de los adultos y un 20-30% de los niños al año y causan 3-5 millones de casos de enfermedades graves y hasta 500.000 muertes en todo el mundo 1. vacunas anuales contra la gripe siguen siendo la mejor opción para prevenir la enfermedad. Esfuerzos como el Plan de Acción Mundial de la OMS han aumentado el uso de la vacuna estacional, la capacidad de producción de vacunas, y la investigación y el desarrollo de estrategias de vacunas más potentes con el fin de reducir la morbilidad y la mortalidad asociadas con brotes de gripe estacional 2. Los medicamentos antivirales como inhibidores de la neuraminidasa (por ejemplo, zanamivir y oseltamivir) están disponibles en algunos países y han demostrado ser eficaces en los síntomas atenuantes, cuando se administra dentro de las primeras 48 h de inicio 3, 4, 5. A pesar de los esfuerzos mundiales, la contención de la gripe estacional outbreaks sigue siendo un desafío formidable en este momento, como el virus de la gripe deriva antigénica a menudo excede capacidades actuales para adaptarse a la genoma cambio de virus 6. estrategias de vacunas dirigidas a nuevas cepas del virus deben ser desarrolladas con antelación y, a veces se vuelven menos de una eficacia óptima debido a los cambios imprevistos en los tipos de cepas que eventualmente predominan en una temporada de gripe. Por estas razones, existe una clara necesidad de desarrollar estrategias terapéuticas alternativas para contener las infecciones y la reducción de la mortalidad. En el logro de una mejor comprensión de la interacción huésped-virus, puede ser posible desarrollar nuevos medicamentos anti-influenza y terapias adyuvantes 7, 8.

El anfitrión de la influenza humana A la interacción del virus (IAV) es compleja. Varios modelos animales de infección IAV humana se han desarrollado con el fin de profundizar en la interacción huésped-virus, INCLUYENDOing ratones, cobayas, ratas del algodón, hámsters, hurones y los macacos 9. Mientras que proporciona datos importantes que han mejorado la comprensión de la dinámica de host-IAV, cada organismo modelo posee inconvenientes importantes que deben ser considerados cuando se trata de traducir los hallazgos en la medicina humana. Por ejemplo, los ratones, que son el modelo más ampliamente utilizado, no desarrollan síntomas de la infección fácilmente inducidas por IAV cuando están infectadas con la gripe humana aísla 9. Esto se debe a que los ratones carecen del tropismo natural para la gripe humana aísla ya que las células epiteliales de ratón expresan alfa-2,3 vínculos de ácido siálico en lugar de los α-2,6 vínculos de ácido siálico expresadas en las células epiteliales humanas 10. Las proteínas hemaglutinina presentes en las cepas humanas IAV favorable se unen y entran en las células anfitrionas teniendo vínculos de ácido siálico alfa-2,6 través de endocitosis mediada por receptor 9, 11, </shasta> 12, 13. Como consecuencia, ahora se acepta que en el desarrollo de modelos de ratón de la influenza humana, se debe tener cuidado para emparejar la cepa apropiada de ratón con la cepa de la gripe apropiada con el fin de lograr fenotipos de la enfermedad que recapitular aspectos de la enfermedad humana. En contraste, las células epiteliales en el tracto respiratorio superior de los hurones poseen 2,6 a-vínculos de ácido siálico que se asemejan a las células humanas 14. Hurones infectados comparten muchas de las características patológicas y clínicas observadas en la enfermedad humana, incluyendo la patogenicidad y la transmisibilidad de los virus de la gripe humana y aviar 14, 15. También son altamente susceptibles a los ensayos de eficacia de vacunas. Sin embargo, el modelo de hurón para la influenza humana tiene varias desventajas, principalmente relacionados con su tamaño y el costo de la cría que hacen adquisición de estadísticamente signifilos datos de peralte desafiantes. Además, los hurones han mostrado previamente diferencias en la farmacocinética de fármacos, biodisponibilidad y toxicidad que hacen probar la eficacia difícil. Por ejemplo, los hurones presentan toxicidad para el canal iónico M2 amantadina inhibidor 16. Por lo tanto, es evidente que en la elección de un modelo animal para estudiar preguntas sobre infecciones IAV humanos, es importante tener en cuenta sus ventajas y limitaciones inherentes, y el aspecto de la interacción huésped-virus que se encuentra bajo investigación.

El pez cebra, Danio rerio, es un modelo de animal que proporciona oportunidades únicas para la investigación de la infección microbiana, el anfitrión de la respuesta inmune, y las posibles terapias de drogas 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, <SUP = "xref"> 24, 25, 26, 27, 28. La presencia de ácidos siálicos unidos a α-2,6 en la superficie de células en el pez cebra sugirió su susceptibilidad a la IAV, que fue confirmada en estudios de infección y la imagen in vivo usando una cepa fluorescente reportero de IAV 19. En el pez cebra infectados por el IAV, aumento de la expresión de los ifnphi1 y MXA transcripciones antivirales indicó que una respuesta inmune innata había sido estimulado, y la patología que se muestra por pez cebra infectados por el IAV, incluyendo edema y la destrucción del tejido, fue similar a la observada en las infecciones de la gripe humana . Por otra parte, el inhibidor de la neuraminidasa antiviral Zanamivir mortalidad limitada IAV y la reducción de la replicación viral en el pez cebra 19.

En este informe, un protocolo para el sistema de iniciacióninfecciones ic IAV en embriones de pez cebra se describe. El uso de zanamivir a dosis clínicamente relevantes como una prueba de principio, la utilidad de este modelo de pez cebra infección IAV para el cribado de compuestos para la actividad antiviral se demuestra. Además, un protocolo para la generación de una infección IAV localizada, epitelial en el pez cebra nadar vejiga, un órgano que se considera que es anatómica y funcionalmente análoga a la de pulmón de mamífero 21, 29, 30, 31, se describe. El uso de este modelo de infección IAV localizada, el reclutamiento de neutrófilos al sitio de la infección se puede seguir, lo que permite las investigaciones sobre el papel de la biología de los neutrófilos en la infección IAV y la inflamación. Estos modelos de pez cebra complementan modelos animales existentes de infecciones IAV humanos y son particularmente útiles para el ensayo de moléculas pequeñas y respuestas de las células inmunitarias debido a la posibilidad de una mayor sATOS ESTADÍSTICOS potencia, capacidad de moderada a ensayos de alto rendimiento, y las habilidades para rastrear el comportamiento celular inmune y la función con la luz-microscopía.

Protocol

Todo el trabajo debe realizarse con nivel de bioseguridad 2 (o BSL2) normas descritas por los Centros para el Control de Enfermedades (CDC) y de conformidad con las directrices establecidas por Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comités (IACUC). Por favor, consultar con los funcionarios adecuados para garantizar la seguridad y el cumplimiento. 1. El pez cebra Cuidado y mantenimiento Desovar pez cebra y recoger el número necesario de embriones para los experimentos. Cu…

Representative Results

Aquí, se proporcionan datos que muestran cómo la infección sistémica IAV en el pez cebra se puede utilizar para probar la eficacia del fármaco (Figura 1A). Los embriones en 48 horas después de la fertilización se inyectan con APR8 (figuras 1C, 1F), X-31 (figuras 1D, 1G), o NS1-GFP (Figuras 1H-1i) a través del conducto de Cuvier para iniciar una infección viral. Otra cohorte de embriones en 48 horas después de l…

Discussion

Para maximizar los beneficios obtenidos por el uso de un pequeño animal para modelar las interacciones huésped-patógeno humano, es importante formular preguntas e hipótesis de investigación prueba que aprovechan las ventajas inherentes del sistema modelo. Como modelo para la infección IAV humana, el pez cebra tiene varios puntos fuertes, incluyendo una alta fecundidad, la claridad óptica, receptividad en la detección de drogas, y la disponibilidad de líneas transgénicas que etiquetan las células inmunes como …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors wish to thank Mark Nilan for zebrafish care and maintenance and Meghan Breitbach and Deborah Bouchard for propagating NS1-GFP and determining IAV titers. This research was supported by NIGMS grant NIH P20GM103534 and the Maine Agricultural and Forest Experiment Station (Publication Number 3493).

Materials

Instant Ocean Spectrum Brands SS15-10
100 x 25 mm sterile disposable Petri dishes  VWR  89107-632
Transfer pipettes  Fisherbrand 13-711-7M
Tricaine- S (MS-222) Western Chemical
Borosilicate glass capillary with filament  Sutter Instrument  BF120-69-10
Flaming/Brown micropipette puller  Sutter Instrument  P-97
Agarose Lonza 50004
Zanamivir AK Scientific G939
Dumont #5 forceps  Electron Microscopy Sciences 72700-D
Microloader tips Eppendorf 930001007
Microscope immersion oil Olympus IMMOIL-F30CC
Microscope stage calibration slide  AmScope MR095
MPPI-3 pressure injector  Applied Scientific Instrumentation
Stereo microscope Olympus SZ61
Back pressure unit Applied Scientific Instrumentation BPU
Micropipette holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
Foot switch Applied Scientific Instrumentation FSW
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Magnetic base Applied Scientific Instrumentation Magnetic Base
Phenol red  Sigma-Aldrich  P-4758
Low temperature incubator VWR 2020
SteREO Discovery.V12 Zeiss
Illuminator Zeiss HXP 200C
Cold light source Zeiss  CL6000 LED
Glass-bottom multiwell plate, 24 well Mattek P24G-0-13-F
Confocal microscope Olympus IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
Fluoview software Olympus
Prism v6 GraphPad
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus  Charles River  490710
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)  Charles River  490715
Influenza NS1-GFP Referenced in Manicassamy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry) Referenced in Lam et al. 2013

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Sullivan, C., Jurcyzszak, D., Goody, M. F., Gabor, K. A., Longfellow, J. R., Millard, P. J., Kim, C. H. Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses. J. Vis. Exp. (119), e55235, doi:10.3791/55235 (2017).

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