抗ウイルス薬をスクリーニングし、宿主の免疫細胞応答を特徴づけるために、ヒトインフルエンザAウイルス感染のゼブラフィッシュモデルを使用して、
Summary
Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.
Abstract
Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.
Introduction
世界保健機関（WHO）によると、インフルエンザウイルスは大人5〜10％であり、毎年子どもたちの20から30までパーセントに感染し、重症の3〜5000000例の原因となり、世界中の1 50万人が死亡。インフルエンザに対する毎年のワクチン接種は、病気を防ぐための最良の選択肢のまま。 WHOグローバル・アクションプランのような取り組みは、季節性インフルエンザの流行2に関連する罹患率および死亡率を減少させるために、季節性ワクチンの使用、ワクチン生産能力、そしてより強力なワクチン戦略の研究開発が増加しています。ノイラミニダーゼ阻害剤（ 例えばザナミビルおよびオセルタミビル）のような抗ウイルス薬は、一部の国で利用可能であり、発症3、4、5の最初の48時間以内に投与された場合、症状を緩和するのに有効であることが証明されています。グローバルな努力にもかかわらず、季節性インフルエンザの封じ込めのouインフルエンザウイルス抗原ドリフトは、多くの場合、ウイルス6の変化ゲノムに適応するために、現在の能力を超えるようtbreaksは、この時点では手ごわい課題です。ウイルスの新たな株を標的とワクチン戦略は、事前に開発されなければならない、時にはにより、最終的にインフルエンザシーズンに優勢株の種類が予期せぬ変化に最適に効果的な未満レンダリングされます。これらの理由から、感染症を含み、死亡率を減少させるための代替的な治療戦略を開発する明確な必要性が存在します。宿主-ウイルス相互作用の理解を達成することにより、新しい抗インフルエンザ薬およびアジュバント療法7,8を開発することが可能です。
ヒト宿主-インフルエンザウイルス（IAV）の相互作用は複雑です。ヒトIAV感染のいくつかの動物モデルがINCLUD、宿主 – ウイルス相互作用への洞察を得るために開発されていますマウス、モルモット、コットンラット、ハムスター、フェレット、およびマカク9る。ホスト-IAVダイナミクスの理解を高めてきた重要なデータを提供しながら、各モデル生物は、ヒトの医療に調査結果を翻訳しようとしたときに考慮しなければならない重大な欠点を有しています。ヒトインフルエンザが9を分離に感染したとき例えば、最も広く使用されているモデルであるマウスは、容易にIAV誘発性感染症の症状を発症しません。マウスは、マウスの上皮細胞ではなくヒト上皮細胞10上で発現α-2,6シアル酸結合のα-2,3シアル酸結合を発現するので、ヒトインフルエンザ自然向性単離物欠いているためです。人間IAVに存在する赤血球凝集素タンパク質は、好意的受容体媒介性エンドサイトーシス9、11を介してα-2,6シアル酸結合を保有する宿主細胞に結合し、入力して隔離します</s12、13>まで。その結果、現在ではヒトインフルエンザのためのマウスモデルを開発中で、ケアは、人間の病気の側面を再現疾患の表現型を達成するために、インフルエンザの適切な株とマウスの適切な歪みをペアリングするために注意しなければならないことが認められています。対照的に、フェレットの上気道上皮細胞は、ヒト細胞14に似ているα-2,6シアル酸結合を有します。感染したフェレットは、ヒトおよび鳥インフルエンザウイルス14、15の病原性と伝達率などのヒト疾患において観察された病理学的および臨床的特徴の多くを共有しています。彼らはまた、ワクチンの有効性試験に非常に適しています。それにもかかわらず、ヒトインフルエンザのためのフェレットモデルは、統計的にsignifiの取得を行い、主にそのサイズと畜産のコストに関連するいくつかの欠点があります挑戦カントデータ。また、フェレットは、以前のテストの有効性を困難にする薬剤の薬物動態、生物学的利用能、および毒性の違いを表示しています。例えば、フェレットはM2イオンチャネル阻害剤、アマンタジン16に毒性を示します。したがって、人間IAV感染症についての質問を研究するための動物モデルを選択する際に、その固有の利点と限界、および調査中であるホストウイルスの相互作用の側面を考慮することが重要であることは明らかです。
ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュ 、微生物感染を調査するためのユニークな機会を提供する動物モデルである、免疫応答をホストし、そして潜在的な薬物療法17、18、19、20、21、22、23、<SUPクラス= "外部参照"> 24、25、26、27、28。ゼブラフィッシュの細胞の表面上のα-2,6結合したシアル酸の存在は、感染研究で裏付けとIAV 19の蛍光レポーター株を用いてin vivoで画像化したIAV、への感受性を示唆しました。 IAV感染ゼブラフィッシュでは、抗ウイルスifnphi1とMXA転写産物の発現増加は、先天性免疫応答が刺激されたことを示し、および浮腫および組織破壊を含むIAV感染ゼブラフィッシュ、で表示される病変は、ヒトインフルエンザ感染で観察されたものと同様でした。また、IAV抗ウイルスノイラミニダーゼ阻害剤ザナミビル限られた死亡率およびゼブラフィッシュ19で減少ウイルス複製。
この報告書では、システムを開始するためのプロトコルゼブラフィッシュ胚におけるIC IAV感染について説明します。プルーフの原理として臨床的に関連する用量でザナミビルを使用して、抗ウイルス活性について化合物をスクリーニングするためのこのゼブラフィッシュIAV感染モデルの有用性が実証されます。さらに、ゼブラフィッシュ浮き袋、解剖学的に哺乳動物の肺21に機能的に類似であると考えられている臓器、29、30、31に局在し、上皮IAV感染を発生するためのプロトコルは、記載されています。この局所的なIAV感染モデルを用いて、感染部位への好中球動員は、IAV感染および炎症における好中球生物学の役割の調査を可能に追跡することができます。これらのゼブラフィッシュモデルは、ヒトIAV感染の既存の動物モデルを補完し、小分子およびので増強の可能性の免疫細胞応答を試験するために特に有用ですtatisticalパワー、ハイスループットアッセイに中程度の能力、および光顕微鏡での免疫細胞の挙動と機能を追跡する能力。
Protocol
Representative Results
Discussion
ヒト宿主 – 病原体相互作用をモデル化するために、小さな動物を使用することから得られる利益を最大化するためには、モデルシステムの固有の利点を生かす研究課題とテスト仮説をフレームに重要です。人間IAV感染のモデルとして、ゼブラフィッシュは、高い繁殖力、光学的透明度、薬物スクリーニングに従順、および好中球などの免疫細胞を標識したトランスジェニック系統の可用性を?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to thank Mark Nilan for zebrafish care and maintenance and Meghan Breitbach and Deborah Bouchard for propagating NS1-GFP and determining IAV titers. This research was supported by NIGMS grant NIH P20GM103534 and the Maine Agricultural and Forest Experiment Station (Publication Number 3493).
Materials
| Instant Ocean | Spectrum Brands | SS15-10 | |
| 100 x 25 mm sterile disposable Petri dishes | VWR | 89107-632 | |
| Transfer pipettes | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| Tricaine- S (MS-222) | Western Chemical | ||
| Borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF120-69-10 | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Zanamivir | AK Scientific | G939 | |
| Dumont #5 forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Microscope immersion oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| Microscope stage calibration slide | AmScope | MR095 | |
| MPPI-3 pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | ||
| Stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Magnetic base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P-4758 | |
| Low temperature incubator | VWR | 2020 | |
| SteREO Discovery.V12 | Zeiss | ||
| Illuminator | Zeiss | HXP 200C | |
| Cold light source | Zeiss | CL6000 LED | |
| Glass-bottom multiwell plate, 24 well | Mattek | P24G-0-13-F | |
| Confocal microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| Prism v6 | GraphPad | ||
| Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus | Charles River | 490710 | |
| Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2) | Charles River | 490715 | |
| Influenza NS1-GFP | Referenced in Manicassamy et al. 2010 | ||
| Tg(mpx:mCherry) | Referenced in Lam et al. 2013 | ||
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