Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.
Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.
El objetivo general de este método consiste en aislar la médula espinal, así como para identificar y aislar los GRD 1, 2. Extrusión hidráulica de la médula espinal es un método significativamente más rápido que la forma tradicional de aislamiento de la médula espinal por laminectomía, es decir, romper la columna vertebral de una en una, y este método reduce el riesgo de daño tisular causado por el proceso de disección de 3, 4 . GRD puede ser difícil de identificar. La identificación correcta es muy importante para el análisis de tejido, por ejemplo después de una lesión del nervio ciático. Al numerar los GRD de acuerdo con su localización con respecto a la costillas, los GRD se pueden identificar de forma coherente.
Tejido aislado por las técnicas demostradas aquí se puede aplicar a una amplia gama de análisis, incluyendo transferencia de Western 5,6, 7 y qPCR tinción inmunohistoquímica 8.
Cuando la identificación de los GRD, es importante tener en cuenta que el número de segmentos de la médula espinal se sabe que varían con el tipo de animal y tensión 9, 10, 11. Las ventajas en la realización de este método en los ratones son el elevado número de variantes modificadas genéticamente disponibles y los gastos relativamente bajos de vivienda. Las ventajas de usar las ratas son el rendimiento tejido relativamente alta y si la participación de las lesiones nerviosas, el procedimiento se aliviaron con el tamaño.
Si se altera la columna vertebral, por ejemplo, por dislocación cervical, la médula espinal se dividirá durante la extrusión. Si la médula espinal no se puede extruir, la columna vertebral puede ser recortado ligeramente en ambos extremos y el intento de extrusión se puede repetir. En caso de que se necesita toda la médula espinal para su posterior análisis, es decir, que consiste en la ampliación de cuello uterino, así como la ampliación lumbar, la columna vertebral sólo debe ser recortado ligeramente. Si sólo se necesita la ampliación lumbar para su posterior análisis, la médula espinal se debe ajustar de acuerdo con el presente protocolo. La columna vertebral debe enderezarse usando las yemas de los dedos para facilitar la extrusión.
El protocolo es aplicable a los roedores de todas las edades y es aquí ejemplificado por un ratón adulto (8 semanas), una cría de ratón (5 días) y una rata adulta (10 semanas). Dependiendo del tipo de animal y la tensión, el número de secciones torácica y lumbar puede variar 9, </sup> 10, 11. Dependiendo de las proteínas a analizar, roedores adultos pueden ser perfundidos con soluciones de inhibidores de enzimas antes de la eutanasia. Si se realiza un experimento con lesión del nervio unilateral, la médula espinal se puede dividir en los lados ipsilaterales y contralaterales utilizando pinzas ultra-finas inmediatamente después de la extrusión. Además, cada lado se puede dividir en lados dorsal y ventral. El tejido puede ser procesada para análisis adicionales, por ejemplo, transferencia Western.
Transcardial perfusión-fijación con PFA antes de la extrusión de la médula espinal debe evitarse, ya que esto hace que la médula espinal no flexible y evita cable de extrusión hidráulica espinal. Hidráulica de extrusión de la médula espinal será arrancar las raíces dorsales. Para los experimentos en los adjuntos raíces dorsales son necesarias, se recomienda laminectomía. Además, meninges espinales se pierden por extrusión hidráulica, que se puede evitar mediante laminectomía estándar <sup class = "xref"> 3.
extrusión hidráulica de la médula espinal y el aislamiento DRG también podría llevarse a cabo utilizando oxigenado líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) en lugar de PBS enfriado en hielo. El uso de ACSF permite la conservación del tejido aislado en un mejor entorno fisiológico, que es particularmente importante en el caso de registros electrofisiológicos posteriores 12, 13. Una alternativa a ACSF podría ser PBS que contiene 1 g / l de glucosa para la generación de cultivos de DRG primaria 14.
extrusión hidráulica de la médula espinal es un método significativamente más rápido que la forma tradicional de aislamiento de la médula espinal por laminectomía, lo que reduce el tiempo de manipulación de tejido y por lo tanto reducir el riesgo de daño a las proteínas. La perfusión con un fijador antes de aislar de la médula espinal por laminectomía puede reducir el riesgo de daños en los tejidos durante la disección y durante la extracción final de lade la médula espinal de la columna vertebral. Sin embargo, la fijación del tejido se opone a su aplicabilidad a los análisis, tales como transferencia Western. Los rendimientos de extrusión hidráulicas estructuralmente tejido intacto 3 adecuado para una gama más amplia de análisis.
la definición constante de los GRD puede ser difícil. Sin embargo, esto es esencial para el análisis de tejido, por ejemplo después de una lesión del nervio ciático. Al numerar los GRD de acuerdo con su localización con respecto a la costillas, los GRD se pueden identificar de forma coherente. La tinción de tejido de la médula espinal, así como de los GRD se puede optimizar mediante la realización de las variaciones de tratamiento de tejido ilustradas descritas en el paso 7 de protocolo.
The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge David Kiel, Aarhus University, for filming and editing. VirtualDub software was used for processing of microscope video sequences. We thank the Danish Research Institute of Translational Neuroscience – DANDRITE, Nordic EMBL Partnership, for access to equipment and the Aarhus University Research Foundation, EU 7FP project PAINCAGE, Det Frie Forskningsrad (DFF) and The Lundbeck Foundation for funding.
Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 14084-08 | For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used |
Centrifuge | Eppendorf | # 5427 R | For centrifugation of homogenized tissue |
Cryostat microtome | Leica Biosystems | # CM 3050 S | For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used |
Forceps, Dumont, # 3 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11231-30 | For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used |
Forceps, Dumont, # 5 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11252-20 | For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100 % | Abbott | # 002185 | For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
Iso-pentane GPR rectapur | VWR chemicals | # 24872.298 | For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
Microtome | Leica Biosystems | # RM 2155 | For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used |
Paraffin wax pellets | Sigma-Aldrich | # 76243 | For paraffin embedding; Other manufacturer may be used |
Paraffin tissue embedding station | Leica Biosystems | # EG1160 | For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used |
Pellet pestel, motor cordless | Sigma-Aldrich | # Z359971-1EA | For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used |
Petri dish, 35 mm | Thermo Fischer Scientific | # 121V | For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used |
Petri dish, 100 mm | Sigma-Aldrich | # P7741 | For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used |
Phosphatase inhibitor, Phosstop | Sigma-Aldrich | # 04906845001 | Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
Pipette tip, 1-200 μl, no filter | Sarstedt | # 70.1189.105 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
Protease inhibitor, Complete | Sigma-Aldrich | # 05892791001 | Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
RNAlater solution | Sigma-Aldrich | # R0901 | For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used |
Rneasy Protect Mini KiT | Qiagen | # 74124 | For RNA isolation; Other manufacturer may be used |
Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11 | Swann-Morton | # REF0203 | For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used |
Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge | Bochem | # 4070 | For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used |
Scissors, 130 mm cutting edge | Hounisen | # 1902.0130 | For isolation of spinal cord (adult rat) |
Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 15009-08 | For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
Standard syringes, 2.5 ml, 5 ml, 10 ml | Terumo | # SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1x and eyepiece 10x | Leica | # 10446370 | Other manufacturer/type may be used |
Sterile PBS | GIBCO | # 10010-015 | For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols |
Syringe needle 23 G x 1", 0.6 x 25 mm | Terumo Neolus | # NN-2325R | For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used |
Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm | Terumo Neolus | # NN-1838S | Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used |
Tissue-Tek | Sakura | # 4583 | Tssue embedding material for later cryosectionning |
TNE-lysis buffer | VWR chemicals | # 10128-582 | For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols |