Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.
Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.
O objectivo geral do presente método é isolar a medula espinal, bem como para identificar e isolar DRGs 1, 2. Extrusão hidráulico da medula espinal é um método significativamente mais rápido do que a forma tradicional de isolamento da medula espinal por laminectomia, ou seja, quebrar as vértebras da coluna vertebral, um de cada vez, e este método reduz o risco de dano tecidual causado pelo processo de dissecção 3, 4 . DRGs podem ser difíceis de identificar. A correta identificação é muito importante para a análise do tecido, por exemplo, após a lesão do nervo ciático. Numerando os DRGs de acordo com a sua localização em relação ao costae, DRGs pode ser identificado de forma consistente.
Tecido isolado pelas técnicas demonstradas aqui pode ser aplicado a uma ampla gama de análises incluindo Western blotting 5,6, 7 e qPCR coloração imuno-histoquímica 8.
Ao identificar DRGs, é importante ter em conta que o número de segmentos da medula espinhal é conhecida a variar com o tipo e estirpe de animais 9, 10, 11. As vantagens de executar este método em ratinhos são o elevado número de variantes geneticamente modificados disponíveis e as despesas relativamente baixas de habitação. As vantagens em utilizar os ratos são o rendimento do tecido relativamente alta e se envolvendo lesões nervosas, o procedimento será facilitado com o tamanho.
Se a coluna vertebral é perturbado, por exemplo, por deslocamento cervical, da medula espinhal vai dividir durante a extrusão. Se a medula espinal não pode ser extrudido, a coluna vertebral pode ser ligeiramente cortadas em ambas as extremidades e a tentativa de extrusão pode ser repetida. No caso de ser necessária toda a medula espinal para análise posterior, isto é, que consiste no alargamento do colo do útero, bem como o alargamento lombar, a coluna vertebral só deve ser ligeiramente cortadas. Se apenas o alargamento lombar é necessário para uma análise mais aprofundada, a medula espinhal deve ser aparado de acordo com o presente protocolo. A coluna vertebral deve ser esticado usando a ponta dos dedos para facilitar a extrusão.
O protocolo é aplicável para roedores de todas as idades e é aqui exemplificada por um rato adulto (8 semanas), um cachorro rato (5 dias) e um rato adulto (10 semanas). Dependendo do tipo de animal e tensão, o número de seções torácica e lombar pode variar 9, </sup> 10, 11. Dependendo das proteínas a ser analisada, roedores adultos pode ser perfundido com soluções inibidoras da enzima antes da eutanásia. Se realizar um experimento envolvendo a lesão do nervo unilateral, a medula espinhal podem ser divididos em lados ipsi e contralaterais, usando uma pinça ultra-finas imediatamente após a extrusão. Além disso, cada um dos lados pode ser dividida em lados dorsal e ventral. O tecido pode então ser processada para análises posteriores, por exemplo, transferência de Western.
Transcardial perfusão-fixação com PFA antes da extrusão da medula espinal deve ser evitada, já que isto torna a medula espinal não-flexível e impede medula espinal extrusão hidráulico. Hidráulica extrusão medula espinhal vai arrancar as raízes dorsais. Para experiências em que são necessários raízes dorsais em anexo, laminectomia é recomendado. Além disso, as meninges espinais são perdidas por extrusão hidráulico, o que pode ser evitado por laminectomia padrão <sup class = "xref"> 3.
extrusão hidráulico da medula espinal e do isolamento de DRG também poderia ser realizada utilizando oxigenado fluido cerebrospinal artificial (ACSF) em vez de PBS gelado. O uso de ACSF permite a preservação do tecido isolado em um melhor ambiente fisiológico, o que é particularmente importante no caso de gravações electrofisiológicos subsequentes 12, 13. Uma alternativa para ACSF poderia ser PBS contendo 1 g / l de glicose para a produção de culturas de DRG primário 14.
extrusão hidráulico da medula espinal é um método significativamente mais rápido do que a forma tradicional de isolamento da medula espinal por laminectomia, reduzindo o tempo de tratamento de tecido e, portanto, diminuindo o risco de danos proteína. A perfusão com um fixador, antes de se isolar a medula espinal por laminectomia pode reduzir o risco de danos no tecido durante a dissecção e durante a remoção final dada medula espinal a partir da coluna vertebral. No entanto, a fixação do tecido impede a sua aplicabilidade a análises, tais como transferência de Western. Rendimentos de extrusão hidráulicos estruturalmente tecido danificado 3 adequado para uma ampla gama de análises.
identificação consistente de DRGs pode ser difícil. No entanto, isso é essencial para a análise de tecido, por exemplo, após lesão do nervo ciático. Numerando os DRGs de acordo com a sua localização em relação ao costae, DRGs pode ser identificado de forma consistente. Coloração de tecidos da medula espinal, bem como de DRGs podem ser optimizadas efectuando as variações de tratamento de tecido ilustradas descritas no protocolo de passo 7.
The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge David Kiel, Aarhus University, for filming and editing. VirtualDub software was used for processing of microscope video sequences. We thank the Danish Research Institute of Translational Neuroscience – DANDRITE, Nordic EMBL Partnership, for access to equipment and the Aarhus University Research Foundation, EU 7FP project PAINCAGE, Det Frie Forskningsrad (DFF) and The Lundbeck Foundation for funding.
Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 14084-08 | For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used |
Centrifuge | Eppendorf | # 5427 R | For centrifugation of homogenized tissue |
Cryostat microtome | Leica Biosystems | # CM 3050 S | For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used |
Forceps, Dumont, # 3 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11231-30 | For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used |
Forceps, Dumont, # 5 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11252-20 | For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100 % | Abbott | # 002185 | For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
Iso-pentane GPR rectapur | VWR chemicals | # 24872.298 | For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
Microtome | Leica Biosystems | # RM 2155 | For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used |
Paraffin wax pellets | Sigma-Aldrich | # 76243 | For paraffin embedding; Other manufacturer may be used |
Paraffin tissue embedding station | Leica Biosystems | # EG1160 | For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used |
Pellet pestel, motor cordless | Sigma-Aldrich | # Z359971-1EA | For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used |
Petri dish, 35 mm | Thermo Fischer Scientific | # 121V | For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used |
Petri dish, 100 mm | Sigma-Aldrich | # P7741 | For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used |
Phosphatase inhibitor, Phosstop | Sigma-Aldrich | # 04906845001 | Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
Pipette tip, 1-200 μl, no filter | Sarstedt | # 70.1189.105 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
Protease inhibitor, Complete | Sigma-Aldrich | # 05892791001 | Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
RNAlater solution | Sigma-Aldrich | # R0901 | For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used |
Rneasy Protect Mini KiT | Qiagen | # 74124 | For RNA isolation; Other manufacturer may be used |
Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11 | Swann-Morton | # REF0203 | For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used |
Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge | Bochem | # 4070 | For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used |
Scissors, 130 mm cutting edge | Hounisen | # 1902.0130 | For isolation of spinal cord (adult rat) |
Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 15009-08 | For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
Standard syringes, 2.5 ml, 5 ml, 10 ml | Terumo | # SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1x and eyepiece 10x | Leica | # 10446370 | Other manufacturer/type may be used |
Sterile PBS | GIBCO | # 10010-015 | For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols |
Syringe needle 23 G x 1", 0.6 x 25 mm | Terumo Neolus | # NN-2325R | For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used |
Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm | Terumo Neolus | # NN-1838S | Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used |
Tissue-Tek | Sakura | # 4583 | Tssue embedding material for later cryosectionning |
TNE-lysis buffer | VWR chemicals | # 10128-582 | For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols |