Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.
Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.
이 방법의 전체 목표는 척수를 분리뿐만 아니라, 2 DRGs 하나를 식별하고 분리한다. 척수의 유압 압출 한번에 척추 추체를 끊어서 즉 절제술에 의한 척수 분리의 전통적인 방법보다 훨씬 더 빠른 방법이며,이 방법은 박리 공정 3, 4에 의한 조직 손상의 위험을 줄여 . DRGs는 식별하기 어려울 수 있습니다. 올바른 식별은 예를 들어, 좌골 신경 손상에 따라 조직 분석을 위해 매우 중요하다. costae에 자신의 현지화 상대에 따라 DRGs 번호 매기기으로 DRGs는 지속적으로 식별 할 수 있습니다.
여기에 입증 된 기술에 의해 격리 조직, 웨스턴 블로 팅 (5)를 포함하여 분석의 넓은 범위에 적용 할 수 있습니다6, qPCR에 7, 면역 조직 화학 염색 (8).
DRGs를 식별 할 때, 척수 세그먼트의 수는 동물의 종류 및 균주도 9,도 10,도 11에 따라 변화하는 것으로 알려져 고려하는 것이 중요하다. 쥐에이 방법을 수행하는 장점은 가능한 유전자 변형 변형과 상대적으로 낮은 주택 비용의 높은 수 있습니다. 래트를 사용의 이점은 상대적으로 높은 수율 조직이며 신경 손상을 포함하는 경우, 절차는 크기가 완화 될 것이다.
척주는 경부 탈구에 의해 예, 방해되는 경우, 척수 압출 동안 분할된다. 척수가 압출 될 수없는 경우, 척주의 양 끝은 약간 줄어들 수 있으며 압출 시도가 반복 될 수있다. 경우 전체 척수 즉 경부 확대뿐만 아니라 요추 확대 구성된 추가 분석을 위해 필요한, 척추는 약간 정돈한다. 단 요추 확대는 추가 분석을 위해 필요하다면, 척수 본 프로토콜에 따라 트리밍한다. 척추는 압출을 용이하게하기 위해 손가락을 사용하여 곧게해야합니다.
이 프로토콜은 모든 연령의 설치류에 적용 가능하고 여기 성체 마우스 (8 주), 마우스 새끼 (5 일) 및 성인 쥐 (10 주)을들 수있다. 동물의 종류 및 변형에 따라 흉추 및 요추 부분의 수는 달라질 수 9 </sup> 10, 11. 단백질에 따라서는 성인 설치류 전에 안락사에 효소 억제 솔루션을 관류 할 수있다, 분석 할 수 있습니다. 한면 신경 손상과 관련된 실험을 행하는 경우, 척수 압출 직후 초 미세 핀셋을 이용하여 동측과 반대측면으로 분할 할 수있다. 또한, 각면은 지느러미와 복부 양쪽으로 분할 할 수 있습니다. 티슈는 상기 분석, 웨스턴 블롯 등을 위해 처리 될 수있다.
이 척수가 아닌 유연한 렌더링 및 척수 유압 압출 방지로 척수 압출 전에 PFA와 Transcardial 관류 – 고정은 피해야한다. 유압 척수 압출 지느러미 뿌리를 떼어 것입니다. 부착 등의 뿌리가 필요한 실험을 위해, 추궁 절제술을 권장합니다. 또한, 척수 수막 표준 추궁 절제술 방지 할 수 있습니다 유압 압출에 의해 손실 <suP 클래스 = "외부 참조"> 3.
척수 및 DRG 분리의 유압 압출 대신 얼음처럼 차가운 PBS의 산소 인공 뇌척수 (ACSF)를 사용하여 수행 할 수 있습니다. ACSF의 사용은 후속 전기 생리 학적 기록 (12, 13)의 경우에 특히 중요하다 더 생리적 환경에서 분리 된 조직을 보존 할 수있다. ACSF에 대한 대안은 PBS가 1g / 차 DRG 문화 (14)의 생성을위한 L 포도당을 포함 수 있습니다.
척수의 유압 압출 절제술에 의한 척수 절연 전통적인 방법, 조직 처리 시간을 감소시키고, 따라서 단백질 손상의 위험을 감소보다 훨씬 더 빠른 방법이다. 고정액으로 관류 전에 박리 과정 및 최종 제거시에 조직 손상의 위험을 감소시킬 수있다 절제술에 의한 척수를 분리로척추에서 척수. 그러나 조직의 고정은 웨스턴 블로 팅 등의 분석에의 적용 가능성을 배제. 유압 압출 수율 분석의 넓은 범위에 적합한 구조적 손상되지 않은 조직 3.
DRGs의 일관된 식별이 어려울 수 있습니다. 그러나, 이것은 예를 들면 좌골 신경 손상에 따라, 조직 분석을 위해 필수적이다. costae에 자신의 현지화 상대에 따라 DRGs 번호 매기기으로 DRGs는 지속적으로 식별 할 수 있습니다. DRGs 현재뿐만 척수 조직 염색 프로토콜 단계 7에 설명 된 예시 조직 치료의 변형을 수행하여 최적화 될 수있다.
The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge David Kiel, Aarhus University, for filming and editing. VirtualDub software was used for processing of microscope video sequences. We thank the Danish Research Institute of Translational Neuroscience – DANDRITE, Nordic EMBL Partnership, for access to equipment and the Aarhus University Research Foundation, EU 7FP project PAINCAGE, Det Frie Forskningsrad (DFF) and The Lundbeck Foundation for funding.
Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 14084-08 | For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used |
Centrifuge | Eppendorf | # 5427 R | For centrifugation of homogenized tissue |
Cryostat microtome | Leica Biosystems | # CM 3050 S | For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used |
Forceps, Dumont, # 3 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11231-30 | For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used |
Forceps, Dumont, # 5 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11252-20 | For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100 % | Abbott | # 002185 | For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
Iso-pentane GPR rectapur | VWR chemicals | # 24872.298 | For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
Microtome | Leica Biosystems | # RM 2155 | For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used |
Paraffin wax pellets | Sigma-Aldrich | # 76243 | For paraffin embedding; Other manufacturer may be used |
Paraffin tissue embedding station | Leica Biosystems | # EG1160 | For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used |
Pellet pestel, motor cordless | Sigma-Aldrich | # Z359971-1EA | For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used |
Petri dish, 35 mm | Thermo Fischer Scientific | # 121V | For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used |
Petri dish, 100 mm | Sigma-Aldrich | # P7741 | For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used |
Phosphatase inhibitor, Phosstop | Sigma-Aldrich | # 04906845001 | Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
Pipette tip, 1-200 μl, no filter | Sarstedt | # 70.1189.105 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
Protease inhibitor, Complete | Sigma-Aldrich | # 05892791001 | Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
RNAlater solution | Sigma-Aldrich | # R0901 | For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used |
Rneasy Protect Mini KiT | Qiagen | # 74124 | For RNA isolation; Other manufacturer may be used |
Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11 | Swann-Morton | # REF0203 | For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used |
Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge | Bochem | # 4070 | For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used |
Scissors, 130 mm cutting edge | Hounisen | # 1902.0130 | For isolation of spinal cord (adult rat) |
Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 15009-08 | For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
Standard syringes, 2.5 ml, 5 ml, 10 ml | Terumo | # SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1x and eyepiece 10x | Leica | # 10446370 | Other manufacturer/type may be used |
Sterile PBS | GIBCO | # 10010-015 | For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols |
Syringe needle 23 G x 1", 0.6 x 25 mm | Terumo Neolus | # NN-2325R | For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used |
Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm | Terumo Neolus | # NN-1838S | Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used |
Tissue-Tek | Sakura | # 4583 | Tssue embedding material for later cryosectionning |
TNE-lysis buffer | VWR chemicals | # 10128-582 | For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols |