We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.
Na maioria dos mamíferos, ossículos auditivos no ouvido médio, incluindo o martelo, bigorna e estribo, são os menores ossos. Nos ratos, uma estrutura óssea chamada a bula auditiva abriga os ossículos, enquanto a cápsula auditiva envolve o ouvido interno, ou seja, a cóclea e canais semicirculares. ossículos murino são essenciais para a audição e, portanto, de grande interesse para os pesquisadores da área de otorrinolaringologia, mas seu metabolismo, desenvolvimento e evolução são altamente relevantes para outros campos. Metabolismo ósseo alterada pode afetar a função auditiva em ratos adultos, e vários ratos gene deficiente mostram mudanças na morfogênese dos ossículos auditivos no útero. Embora ossículos auditivos murino são minúsculos, sua manipulação é viável se se compreende a sua orientação anatômica e estrutura 3D. Aqui, descrevemos como dissecar a bula auditiva e cápsula de ratos pós-natais e em seguida isolar ossículos individuais através da remoção de parte da bula. Nós também discutir como emcama da bolha e da cápsula em orientações diferentes para gerar parafina ou secções congeladas adequados para a preparação de secções longitudinais, horizontais, ou frontais do cabo do martelo. Finalmente, enumerar as diferenças anatômicas entre mouse e ossículos auditivos humanos. Estes métodos seriam úteis na análise dos aspectos patológicos, de desenvolvimento e evolutivas de ossículos auditivos e da orelha média em camundongos.
Os três ossículos auditivos do ouvido médio, ou seja, martelo, bigorna e estribo, formam uma cadeia auditiva específica de mamíferos que transmite som a partir da membrana timpânica ao ouvido interno, ou cóclea 1,2. Função auditiva pode ser avaliada em ratos medindo Auditivo de Tronco Encefálico (ABR) limiares 3-6, e vibração do martelo atrás da membrana timpânica pode ser monitorado usando Laser Doppler vibrometria (LDV) 7. Ao combinar ABR, LDV e medidas Produto de Distorção de Emissões Otoacústicas (EOAPD), perda auditiva condutiva pode ser discriminado de deficiência neurossensorial 8.
são necessários modelos animais de condições de orelha, dada a importância da audição e a saúde do ouvido para o bem-estar dos pacientes de todas as idades. Por exemplo, otite média é uma infecção no ouvido extremamente comum visto em lactentes e crianças humanas, e, otite média aguda grave e suas complicações podem ocorrer se a condição não for tratada com antimicrobianos apropriados 9. Modelos de rato de otite média pode ser útil na compreensão da patogênese e no desenvolvimento de tratamentos 10,11.
Ossículos murino, que (com excepção da parte goniale do martelo) são formados por ossificação endocondral 12,13, são altamente relevantes para o estudo do metabolismo ósseo e morfogênese. Em primeiro lugar, seu pequeno tamanho permite a análise de alta resolução de ossos com um periósteo intacto usando raios-X ou microscopia de fluorescência 14. Em segundo lugar, o metabolismo ósseo anormal, como a reabsorção óssea excessiva ou deficiente, ou interações deficientes entre as células ósseas 15, pode ser analisado como um contribuinte potencial de perda auditiva 3,4,7. Em terceiro lugar, a morfogénese ossículo anormal é relatada em vários ratinhos deficientes em genes, tais como animais que faltam Hoxa2 16-19, 20-22 Msx1, Prrx1 23, Goosecoid(GSC) 24,25, Bapx1 13, Tshz1 26, Dusp6 (mkp3) 27, Noggin (Nog) 28, FGFR1 29, os receptores da hormona da tiróide (Thra, Thrb) 5, Bcl2 30 e outros 1,31, ou em camundongos com superexpressão Hoxa2 32. Finalmente, apesar de seu pequeno tamanho, estruturas associado com ossículos, como músculos e articulações 33 34,35 são acessíveis.
ossículos do rato são menores do que ossículos humanos, mas é digno de nota que a orelha média do rato não é uma versão em miniatura de sua contraparte humana. Por exemplo, em ratos, a artéria estapediano, que passa através do anel do estribo, persistir ao longo da vida 36, enquanto que em seres humanos, a artéria estapediano embrionária desaparece durante a gestação. Além disso, a morfologia do martelo do rato difere da do the osso humano (ver Figura 6). Em camundongos, a bula auditiva (timpânica) encerra a cavidade do ouvido médio cheio de ar, enquanto que em seres humanos, as células aéreas da mastóide compostas de osso trabecular no osso temporal abriga os ossículos, em vez de uma bolha 37. Em ambas as espécies, a cápsula auditiva (cápsula ótica, labirinto ósseo) encerra a cóclea e canais semicirculares do ouvido interno. Biologia comparada e evolutiva do ouvido médio tem sido extensivamente revisado 38-40.
O protocolo fornecido abaixo primeira descreve como dissecar a bula auditiva e cápsula, que consistem principalmente de orelha média e orelha interna, respectivamente. Este protocolo também demonstra como isolar o martelo, bigorna e estribo da bula auditiva. Finalmente, ele mostra como orientar a bula auditiva e da cápsula para embutir em preparação para o seccionamento de tecidos de ossículos auditivos.
Aqui, apresentamos um método útil para isolar a bula auditiva e cápsula em ratos pós-natais. Antes da P12, os tecidos são frágeis e podem ser danificados durante o isolamento. Após P12, o bula auditiva e da cápsula pode ser facilmente isolado a partir de tecidos circundantes. Dissecando a bula da cabeça antes do corte tem várias vantagens. Em primeiro lugar, cavitação pós-natal e do crescimento da bula auditiva ocorrer mais ativamente da P6 em diante e são completos por P14 50. O tecido mesenquimal entre a membrana timpânica e parede coclear é substituído por ar através do processo de cavitação. O ar resultante na cavidade do ouvido médio pode impedir o contato entre os tecidos e líquidos durante a fixação, descalcificação e incorporação. É mais fácil para remover o ar da bula auditiva isolada, cortando o final (processo styliform) anterior ao invés de tentar fazê-lo na bula não isolado. Em segundo lugar, a orientação do martelo (e a membrana timpânica) não é verticalna cabeça. É, portanto, mais fácil de secção do martelo em planos desejados pela incorporação da bula auditiva isolada e cápsula em uma determinada orientação.
Uma vez isolado, bula auditiva e cápsulas são úteis para numerosas análises. Por exemplo, de alta resolução de raios-X micro-CT pode revelar morfologia microestrutura do osso, tais como capilares osteogênicos no martelo 14. O microscópio de dissecação stereofluorescence é uma ferramenta poderosa para avaliar visualização das estruturas em ratinhos que expressam proteínas fluorescentes do repórter no ouvido médio ou interno 33. Além disso, pode ser realizada uma variedade in vivo ou ex vivo de fluorescência métodos de marcação e detecção de imunofluorescência de montagem inteira. A microscopia de fluorescência folha de luz também é útil para a análise tridimensional 51. Embora não seja descrito aqui, diversas estruturas anatômicas associado com a bula auditiva e da cápsula, como os nervos periféricos, vasos sanguíneos, emembrana timpânica no ouvido médio também pode ser avaliada usando esse protocolo.
Note-se que o seccionamento de parafina requer descalcificação do tecido ósseo antes de incorporação e, portanto, não permite a análise de mineralização. Em contraste, o método de Kawamoto filme 43 usado para preparar secções congeladas pode ser realizada sem descalcificação e é adequado para estudos de mineralização utilizando técnicas de rotulagem de osso in vivo ou coloração especial, tais como coloração Alizarina. condições Cryo-seccionamento deve ser otimizada de acordo com base na idade mouse. Por exemplo, uma temperatura inferior fresco no interior da câmara criostato é recomendado para amostras mais velhas do rato para minimizar os danos para as secções.
No rato, o termo correto para a protuberância semi-esférica de destaque do martelo é "apófise orbicular". No entanto, o termo "processus brevis" tem sido amplamente utilizada para indicar a apófise orbicular para mais thum duas décadas, especialmente entre rato biólogos do desenvolvimento 16,20,22-25. "Processus brevis" originalmente se referia ao processo lateral (processus lateral), que difere da apófise orbicular. Em seres humanos, um processo lateral semelhante a uma ligeira projecção cónica forma geral a linha de ligação à membrana timpânica, que se estende a partir da fúrcula (não visto na Figura 6B, vista medial). Em ratinhos, o processo lateral é também uma projecção do manubrium na extremidade oposta ao umbo 48. Os pars flácida da membrana timpânica está acima do processo lateral do martelo. apófise orbicular não é aparente no martelo humano.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.
Tools/Equipment | |||
Paper towel | DAIO PAPER CORPORATION | 703347 | can be purchased from other vendors |
Glass Jar | Various | can be purchased from other vendors | |
14cm surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 91400-14 | can be purchased from other vendors |
Extra fine scissors-straight | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14084-08 | can be purchased from other vendors |
Fine Forceps Angled 45° | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11063-07 | can be purchased from other vendors |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ800N | for routine dissection |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ18 | for movies |
Injection needle 27G | TERUMO | NN-2719S | |
Syringe (1ml) | TERUMO | SS-01T | |
Marking Pin | Various | ||
Tube rotator RT-50 | TAITEC | 0000165-000 | can be purchased from other vendors |
Cryostat | Leica | CM3050S | http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/ |
TC-65 Tungsten blade | Leica | 14021626379 | for Kawamoto's firm method |
Stainless containers | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Cryofilm type IIC | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Silane coated slide (New Silane II) | Muto Pure Chemicals | 511617 | can be purchased from other vendors |
Cover glass | Matsunami | can be purchased from other vendors | |
Tissue processor | Sakura Finetek | VIP-5 | can be purchased from other vendors |
Tissue Embedding Console System | Sakura Finetek | Tissue-Tek TEC 5 | can be purchased from other vendors |
Sliding microtome for paraffin | Yamato Kohki Industrial | REM-710 | can be purchased from other vendors |
Path Blade+pro for hard tissue | Matsunami | PB3503C | for paraffin section |
Micro-CT | RIGAKU | R_mCT2 | http://www.rigaku.com/en |
Fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-9000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Isoflurane | Maruishi pharmaceutical Co. Ltd | ||
NaCl | wako | 191-01665 | for PBS |
KCl | wako | 285-14 | for PBS |
Na2HPO4 12H2O | wako | 196-02835 | for PBS |
KH2PO4 | wako | 287-21 | for PBS |
Paraformaldehyde(EM Grade) | TAAB | P001 | |
EDTA-2Na | wako | 15111-45 | |
Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
Super Cryoembedding Medium | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Dry Ice | Various | for Kawamoto's firm method | |
Hexane | wako | 080-03423 | for Kawamoto's firm method |
Super Cryomouting Medium type R2 | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Paraffin | Sakura Finetek | 781001A0107 | |
Histo-Clear | NDS | HS-200 | |
Calcein | DOJINDO | 340-00433 | |
Hematoxylin | wako | 131-09665 | |
Eosin | wako | 051-06515 |