We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.
In de meeste zoogdieren gehoorbeentjes van het middenoor, zoals de hamer, aambeeld en stijgbeugel, zijn de kleinste botten. Bij muizen, een benige structuur genaamd de auditieve bulla herbergt de gehoorbeentjes, terwijl de auditieve capsule het binnenoor, namelijk het slakkenhuis en halfcirkelvormige kanalen omsluit. Murine gehoorbeentjes zijn essentieel voor het gehoor en dus van groot belang voor onderzoekers op het gebied van KNO, maar hun metabolisme, de ontwikkeling en evolutie zeer relevant zijn voor andere gebieden. Veranderde het botmetabolisme kan invloed hebben op het gehoor functie bij volwassen muizen, en diverse gen-deficiënte muizen vertonen veranderingen in de morfogenese van gehoorbeentjes in de baarmoeder. Hoewel muizen gehoorbeentjes zijn klein, hun manipulatie haalbaar is als men hun anatomische oriëntatie en 3D-structuur begrijpt. Hier beschrijven we hoe de auditieve bulla en de capsule van postnatale muizen ontleden en vervolgens te isoleren individuele gehoorbeentjes door een deel van de bulla verwijderen. We bespreken ook hoe je emhet bed van de bulla en de capsule in verschillende oriëntaties voor het genereren van paraffine of ingevroren secties geschikt zijn voor de bereiding van de lengterichting, horizontaal of frontale delen van de hamer. Tot slot noemen we anatomische verschillen tussen muis en mens gehoorbeentjes. Deze methoden zou nuttig zijn bij het analyseren van pathologische, ontwikkelings- en evolutionaire aspecten van de gehoorbeentjes en het middenoor bij muizen zijn.
De drie gehoorbeentjes van het middenoor, namelijk de hamer, aambeeld en stijgbeugel, vormen een zoogdier-specifieke auditief keten die geluid uitzendt van het trommelvlies naar het binnenoor of cochlea 1,2. Hoorzitting functie kan in muizen worden geëvalueerd door het meten van BAER-test (ABR) drempelwaarden 3-6, en de trillingen van de hamer achter het trommelvlies kan worden gecontroleerd met behulp van Laser Doppler vibratiemeting (LDV) 7. Door het combineren van ABR, LDV en Distortion Product Otoakoestische Emission (DPOAE) metingen kan geleidende gehoorverlies te onderscheiden van perceptief impairment 8.
Diermodellen van oor omstandigheden nodig, gezien het belang van het gehoor en gezondheid oor aan het welzijn van patiënten van alle leeftijden. Bijvoorbeeld otitis media is een veel voorkomende oorontsteking waargenomen bij humane zuigelingen en kinderen, en ernstige, acute otitis media en de complicaties kunnen optreden als de conditie is niet behandeld met geschikte antimicrobiële stoffen 9. Muismodellen van otitis media kan nuttig zijn bij het begrijpen van de pathogenese en in het ontwikkelen van behandelingen 10,11.
Murine gehoorbeentjes, die (met uitzondering van de goniale deel van de hamer) gevormd door endochondrale ossificatie 12,13, zijn bijzonder relevant voor de studie van het botmetabolisme en morfogenese. Ten eerste, hun kleine formaat maakt hoge-resolutie analyse van de botten met een intacte beenvlies met X-ray of fluorescentiemicroscopie 14. Ten tweede, afwijkende botmetabolisme, zoals overmatige of deficiënte botresorptie of verminderde interacties tussen botcellen 15, kan worden opgevat als een mogelijke bijdrage aan gehoorverlies 3,4,7. Ten derde, abnormale beentje morfogenese wordt vermeld voor diverse gen-deficiënte muizen, zoals dieren ontbreken Hoxa2 16-19, 20-22 MSX1, Prrx1 23, Goosecoid(Gsc) 24,25, Bapx1 13, Tshz1 26, Dusp6 (Mkp3) 27, Noggin (Nog) 28, FGFR1 29, schildklierhormoon receptoren (Thra, Thrb) 5, Bcl2 30 en anderen 1,31, of in muizen overexpressie Hoxa2 32. Tot slot, ondanks hun geringe omvang, structuren in verband met de gehoorbeentjes, zoals spieren en gewrichten 33 34,35 toegankelijk zijn.
Muis gehoorbeentjes kleiner dan menselijke gehoorbeentjes, maar het is opmerkelijk dat de muis middenoor geen miniatuurversie van zijn menselijke tegenhanger. Bijvoorbeeld, in muizen, de stapediale slagader, die door de ring van de stijgbeugel geeft blijft gedurende het hele leven 36, terwijl bij de mens, de embryonale stapediale slagader verdwijnt tijdens de dracht. Bovendien, de morfologie van de muis hamer verschilt van die van de menselijk bot (zie figuur 6). Bij muizen, de auditieve (trommelvlies) bulla omsluit de met lucht gevulde middenoor holte, terwijl bij de mens, mastoideus luchtcellen bestaat uit trabeculair bot in het slaapbeen bevindt zich de gehoorbeentjes in plaats van een bulla 37. In beide soorten, de auditieve capsule (Otic capsule, knokige labyrint) omsluit het slakkenhuis en halfcirkelvormige kanalen van het binnenoor. Vergelijkende en evolutionaire biologie van het middenoor is uitgebreid beoordeeld 38-40.
Het protocol voorzien hieronder eerst beschreven hoe te ontleden het auditieve bulla en de capsule, die voornamelijk bestaan uit het middenoor en het binnenoor, respectievelijk. Dit protocol toont ook aan hoe de hamer, aambeeld en stijgbeugel van het auditieve bulla te isoleren. Tot slot, het laat zien hoe de auditieve bulla en de capsule te oriënteren voor het inbedden in de voorbereiding op het weefsel snijden van de gehoorbeentjes.
Hier presenteren we een methode nuttig voor de auditieve bulla en capsule postnatale muizen te isoleren. Vóór P12, weefsels kwetsbaar en kan worden beschadigd tijdens isolatie. Na P12, kan de auditieve bulla en de capsule gemakkelijk worden geïsoleerd van de omliggende weefsels. Opheldering van de bulla van het hoofd voor het snijden heeft verschillende voordelen. Ten eerste postnatale cavitatie en groei van de auditieve bulla komen het meest actief van P6 verder en volledig door 50 P14. De mesenchymale weefsel tussen het trommelvlies en cochleaire wand wordt vervangen door lucht door de cavitatie proces. De resulterende lucht in het middenoor holte contact tussen weefsels en vloeistoffen tijdens fixatie, ontkalken en inbedding belemmeren. Het is gemakkelijker om de lucht uit de geïsoleerde auditieve bulla verwijderen door het afsnijden van het voorste einde (styliform proces) in plaats van te proberen om dit te doen in de ongeïsoleerde bulla. Ten tweede, oriëntatie van de Malleus (en het trommelvlies) is niet verticaalin het hoofd. Daarom is het makkelijker om het gedeelte Malleus in de gewenste vlakken door het inbedden van de geïsoleerde auditieve bulla en capsule in een bepaalde richting.
Eenmaal geïsoleerd, auditieve bulla en capsules zijn geschikt voor talrijke analyses. Zo kan een hoge resolutie Röntgenstralen micro-CT bone microstructuur morfologie onthullen zoals osteogene capillairen in de hamer 14. De stereofluorescence ontleden microscoop is een krachtig hulpmiddel om structuren te visualiseren in de evaluatie van reporter muizen die fluorescerende eiwitten in het midden of binnenoor 33. Daarnaast zijn er diverse in vivo of ex vivo fluorescentie etikettering methoden en hele mount immunofluorescentie detectie kunnen worden ondernomen. Licht sheet fluorescentiemicroscopie is ook nuttig voor driedimensionale analyse 51. Hoewel hier niet beschreven, diverse anatomische structuren geassocieerd met de auditieve bulla en capsule zoals perifere zenuwen, bloedvaten enhet trommelvlies in het middenoor kan worden geëvalueerd met dit protocol.
Merk op dat paraffine snijden vereist ontkalking van het bot weefsels voor het inbedden en dus niet de analyse van de mineralisatie mogelijk te maken. Daarentegen kan de Kawamoto filmmethode 43 gebruikt om ingevroren secties bereiden worden uitgevoerd zonder ontkalking en is geschikt voor mineralisatie studies met in vivo been labeling technieken of specifieke kleuringen zoals alizarine kleuring. Cryo-snijden voorwaarden moeten worden geoptimaliseerd volgens op basis van de muis leeftijd. Zo wordt een minder koele temperatuur in de cryostaatkamer aanbevolen voor oudere muis specimens schade aan onderdelen te minimaliseren.
In de muis, de juiste term voor de prominente semi-bolvormig uitsteeksel van de Malleus is "orbicular apophysis". Toch is de term "processus brevis" wordt algemeen gebruikt om de circulaire apophysis meer th aangeveneen twee decennia, met name onder muis ontwikkelingsstoornissen biologen 16,20,22-25. "Processus brevis" oorspronkelijk verwezen naar de laterale proces (processus lateralis), die verschilt van de kringspieren apophysis. Bij mensen een laterale proces lijkt op een klein conisch uitsteeksel vormt de algemene regel van bevestiging aan het trommelvlies, zich vanaf het manubrium (niet gezien in figuur 6B, mediaal aanzicht). In muizen, de laterale proces is een projectie van het manubrium aan het andere uiteinde naar umbo 48. De pars flaccida van het trommelvlies is boven het laterale proces van de hamer. Orbicular apophysis is niet duidelijk in het menselijk hamer.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.
Tools/Equipment | |||
Paper towel | DAIO PAPER CORPORATION | 703347 | can be purchased from other vendors |
Glass Jar | Various | can be purchased from other vendors | |
14cm surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 91400-14 | can be purchased from other vendors |
Extra fine scissors-straight | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14084-08 | can be purchased from other vendors |
Fine Forceps Angled 45° | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11063-07 | can be purchased from other vendors |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ800N | for routine dissection |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ18 | for movies |
Injection needle 27G | TERUMO | NN-2719S | |
Syringe (1ml) | TERUMO | SS-01T | |
Marking Pin | Various | ||
Tube rotator RT-50 | TAITEC | 0000165-000 | can be purchased from other vendors |
Cryostat | Leica | CM3050S | http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/ |
TC-65 Tungsten blade | Leica | 14021626379 | for Kawamoto's firm method |
Stainless containers | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Cryofilm type IIC | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Silane coated slide (New Silane II) | Muto Pure Chemicals | 511617 | can be purchased from other vendors |
Cover glass | Matsunami | can be purchased from other vendors | |
Tissue processor | Sakura Finetek | VIP-5 | can be purchased from other vendors |
Tissue Embedding Console System | Sakura Finetek | Tissue-Tek TEC 5 | can be purchased from other vendors |
Sliding microtome for paraffin | Yamato Kohki Industrial | REM-710 | can be purchased from other vendors |
Path Blade+pro for hard tissue | Matsunami | PB3503C | for paraffin section |
Micro-CT | RIGAKU | R_mCT2 | http://www.rigaku.com/en |
Fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-9000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Isoflurane | Maruishi pharmaceutical Co. Ltd | ||
NaCl | wako | 191-01665 | for PBS |
KCl | wako | 285-14 | for PBS |
Na2HPO4 12H2O | wako | 196-02835 | for PBS |
KH2PO4 | wako | 287-21 | for PBS |
Paraformaldehyde(EM Grade) | TAAB | P001 | |
EDTA-2Na | wako | 15111-45 | |
Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
Super Cryoembedding Medium | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Dry Ice | Various | for Kawamoto's firm method | |
Hexane | wako | 080-03423 | for Kawamoto's firm method |
Super Cryomouting Medium type R2 | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Paraffin | Sakura Finetek | 781001A0107 | |
Histo-Clear | NDS | HS-200 | |
Calcein | DOJINDO | 340-00433 | |
Hematoxylin | wako | 131-09665 | |
Eosin | wako | 051-06515 |