We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.
대부분의 포유 동물에서, 추골, 침골과 등골을 포함한 중간 귀에 청각 소골은 작은 뼈이다. 마우스에서, 뼈 구조는 청각 캡슐은 내이, 즉 달팽이관과 반원형 운하를 둘러싼 반면 청각 수포가, 이소골을 수용했다. 쥐 이소골은 이비인후과 분야의 연구자들에게 큰 관심 때문에 청각에 필수적인, 그러나 그들의 대사, 개발 및 발전은 다른 분야에 매우 적합하다. 변경된 뼈 대사는 성인 쥐에서 청각 기능에 영향을 미칠 수 있으며, 다양한 유전자가 결핍 된 마우스는 자궁에서 청각 이소골의 형태 형성의 변화를 보여줍니다. 쥐의 청각 이소골이 작은 있지만 하나가 자신의 해부학 적 방향 및 3D 구조를 이해하면, 자신의 조작이 가능하다. 여기, 우리는 청각 수포 및 출생 후의 마우스의 캡슐을 해부 한 후 수포의 일부를 제거하여 개별 이소골을 분리하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 또한 토론 방법을 그들에게다른 방향에서 침대 수포와 캡슐은 추골의 길이 방향 수평, 또는 정면 부분의 준비를위한 파라핀 또는 동결 절편에 적합 생성합니다. 마지막으로, 우리는 마우스와 인간의 청각 이소골 사이의 해부학 적 차이점을 열거. 이러한 방법은 청각 이소골의, 병리학 적 발달과 진화 적 측면과 생쥐의 중이 분석에 유용 할 것이다.
중이의 세 청각 이소골, 즉 추골, 침골 및 등골은 고막 안쪽 귀에 막, 또는 달팽이관 1, 2에서 사운드를 전달하는 포유 동물의 특정 청각 체인을 형성한다. 청각 기능이 청성 뇌간 반응 (ABR) 3-6, 및 레이저 도플러 Vibrometry (LDV) 7을 사용하여 모니터링 할 수있는 고막 뒤에있는 추골의 진동을 임계 값을 측정하여 마우스에서 평가 될 수있다. ABR, LDV 및 왜곡 제품 Otoacoustic 방출 (DPOAE) 측정을 결합함으로써, 전도성 난청은 감각 신경성 장애 8 구별 할 수 있습니다.
귀 조건의 동물 모델은 모든 연령의 환자의 복지를 듣고 귀 건강의 중요성을 고려할 필요가있다. 예를 들어, 중이염은 인간의 유아와 어린이, 심한 급성 중이염에서 볼 매우 일반적인 귀 감염과 합병증은 CONDI 경우에 발생할 수 있습니다기 적절한 항균제 (9)으로 처리되지 않습니다. 중이염의 마우스 모델은 발병 기전을 이해하고 치료 10,11 개발에 유용 할 수 있습니다.
(추골의 goniale 부분 제외) 연골 골화 (12, 13)에 의해 형성된다 쥐 이소골은 뼈 대사 및 형태 형성의 연구에 매우 적합하다. 첫째, 작은 크기는 X 선 또는 형광 현미경을 이용하여 14 온전한 골막과 뼈 고해상도 분석을 허용한다. 둘째, 골 세포 중 15 과부족 뼈 흡수 또는 손상 작용 등 비정상적 골 대사, 손실 3,4,7 청각에 잠재적 참여자로 분석 될 수있다. 셋째, 이상 골편의 형태 형성은 이러한 Hoxa2 16 ~ 19, 20 ~ 22 Msx1, Prrx1 23 Goosecoid가없는 동물 등 여러 가지 유전자 결핍 마우스에보고(GSC) 24, 25, Bapx1 13 Tshz1 26 Dusp6 (Mkp3) (27)는, 소량 (노그) 28 FGFR1 (29)는 마우스에서 갑상선 호르몬 수용체 (치환술, Thrb) 5에서 Bcl2 (30) 등 1,31은, 또는 과발현 Hoxa2 32. 마지막으로, 작은 크기에도 불구하고, 구조는 근육 (33)과 관절 (34, 35) 등의 이소골과 관련된 액세스 할 수 있습니다.
마우스 골편 인간 골편보다 작은하지만 마우스 중이는 인간 상대의 소형 버전이 아님을 주목할 필요가있다. 인간의 배아 stapedial 동맥이 임신 중에 사라 반면, 예를 들어, 마우스에, 등골의 고리를 통과하는 stapedial 동맥, 삶 (36)에 걸쳐 지속. 또한, 마우스 추골의 형태가 일의 상이즉 인간의 골 (도 6 참조). 인간은 측두골의 소주 골 이루어지는 유양동 공기 전지는 수포 37보다는 골편을 수용하는 반면 쥐에서는, 청각 (고막) 수포는 공기 충전 중이 캐비티를 둘러싼 다. 두 종으로, 청각 캡슐 (귀 캡슐, 뼈 미로)는 달팽이관 및 내이의 반원형 운하를 둘러싼 다. 중이의 비교 및 진화 생물학은 광범위 38-40을 검토하고있다.
먼저 아래의 프로토콜은 각각, 주로 중이 및 내이 구성 청각 수포 및 캡슐을 해부하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 청각 수포에서 추골, 침골과 등골을 분리하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 청각 이소골의 조직 절편에 대비하여 내장의 청각 수포 및 캡슐 방향을하는 방법을 보여줍니다.
여기, 우리는 출생 후의 쥐의 청각 수포 및 캡슐을 분리하는 유용한 방법을 제시한다. P12에 앞서, 조직은 연약하고 격리하는 동안 손상 될 수 있습니다. P12 후, 청각 수포 및 캡슐은 쉽게 주변 조직으로부터 분리 할 수있다. 절편 전에 머리에서 수포를 해부하는 것은 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 출생 캐비테이션 및 청각 수포의 성장이 가장 활발 이후 P6에서 발생 P14 (50)에 의해 완료됩니다. 고막과 달팽이관 벽 사이의 중간 엽 조직은 캐비테이션 과정을 통해 공기로 대체됩니다. 중간 귀 구멍에 생성 된 공기는 고정, 탈회 및 삽입하는 동안 조직과 액체 사이의 접촉을 방해 할 수 있습니다. 앞쪽 끝 (styliform 프로세스)를 차단보다는 unisolated 수포에서 그렇게 노력에 의해 분리 된 청각 수포에서 공기를 제거하는 것이 더 쉽습니다. 둘째, 추골 (그리고 고막)의 방향이 수직 아니다머리있다. 그것은 주어진 방향으로 고립 된 청각 수포 및 캡슐을 삽입하여 원하는 평면의 추골을 섹션에 따라서 용이하다.
고립되면, 청각 수포 및 캡슐은 수많은 분석에 유용하다. 예를 들어, 고해상도 X 선 마이크로 CT는 추골 (14)의 골 형성 모세 혈관으로 뼈의 미세 구조 형태를 공개 할 수 있습니다. stereofluorescence 해부 현미경은 중간 또는 내이 (33)에 형광 단백질을 발현하는 기자 마우스를 평가하는 구조를 시각화하는 강력한 도구입니다. 또한, 생체 내 또는 생체 형광 표시 방법과 전체 마운트 면역 형광 검출의 다양한이 수행 될 수있다. 가벼운 시트 형광 현미경은 입체 분석 (51)에 유용합니다. 여기에 설명되지 않았지만, 다양한 해부학 적 구조는 말초 신경, 혈관 등의 청각 수포 및 캡슐과 연관중간 귀의 고막의이 프로토콜을 이용하여 평가 될 수있다.
그 파라핀 절편이 광물의 분석을 허용하지 않습니다 때문에 삽입하기 전에 뼈 조직의 탈회를 요구하고 있습니다. 대조적으로, 동결 절편을 제조하는 데 사용되는 막 모토 방법 43 탈회없이 수행 및 알리자린 염색 등의 생체 골 분류 기술 또는 특수 염색에 사용 광물 연구에 적합 할 수있다. 극저온 절편 조건은 마우스 연령에 따라 따라 최적화되어야한다. 예를 들어, 저온 유지 챔버 내부의 적은 시원한 온도는 부분의 손상을 최소화하기 위해 이전 마우스 표본을 권장합니다.
마우스에서, 추골의 눈에 띄는 반구형 돌기에 대한 올바른 용어는 "공 모양의 융기"입니다. 그럼에도 불구하고, 용어 "이 과정이 브레비스"는 더 널리 번째위한 공 모양의 융기를 나타내는 데 사용 된특히 마우스 발달 생물 학자 16,20,22-25들 사이에서 이십년. "이 과정이 브레비스"원래 공 모양의 융기와 다른 측면 과정 (이 과정이이 lateralis), 함. 인간에서 약간의 원추형 돌기를 닮은 측면 과정 (안 그림 6B, 중간에서 볼)에 흉골로부터 연장, 고막에 부착의 일반 라인을 형성한다. 마우스에서, 횡 프로세스는 umbo 48 반대쪽의 흉골의 투영이다. 고막의 유리체의 flaccida은 추골의 측면 과정 이상입니다. 공 모양의 융기는 인간의 추골에서 알 수 없습니다.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.
Tools/Equipment | |||
Paper towel | DAIO PAPER CORPORATION | 703347 | can be purchased from other vendors |
Glass Jar | Various | can be purchased from other vendors | |
14cm surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 91400-14 | can be purchased from other vendors |
Extra fine scissors-straight | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14084-08 | can be purchased from other vendors |
Fine Forceps Angled 45° | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11063-07 | can be purchased from other vendors |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ800N | for routine dissection |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ18 | for movies |
Injection needle 27G | TERUMO | NN-2719S | |
Syringe (1ml) | TERUMO | SS-01T | |
Marking Pin | Various | ||
Tube rotator RT-50 | TAITEC | 0000165-000 | can be purchased from other vendors |
Cryostat | Leica | CM3050S | http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/ |
TC-65 Tungsten blade | Leica | 14021626379 | for Kawamoto's firm method |
Stainless containers | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Cryofilm type IIC | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Silane coated slide (New Silane II) | Muto Pure Chemicals | 511617 | can be purchased from other vendors |
Cover glass | Matsunami | can be purchased from other vendors | |
Tissue processor | Sakura Finetek | VIP-5 | can be purchased from other vendors |
Tissue Embedding Console System | Sakura Finetek | Tissue-Tek TEC 5 | can be purchased from other vendors |
Sliding microtome for paraffin | Yamato Kohki Industrial | REM-710 | can be purchased from other vendors |
Path Blade+pro for hard tissue | Matsunami | PB3503C | for paraffin section |
Micro-CT | RIGAKU | R_mCT2 | http://www.rigaku.com/en |
Fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-9000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Isoflurane | Maruishi pharmaceutical Co. Ltd | ||
NaCl | wako | 191-01665 | for PBS |
KCl | wako | 285-14 | for PBS |
Na2HPO4 12H2O | wako | 196-02835 | for PBS |
KH2PO4 | wako | 287-21 | for PBS |
Paraformaldehyde(EM Grade) | TAAB | P001 | |
EDTA-2Na | wako | 15111-45 | |
Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
Super Cryoembedding Medium | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Dry Ice | Various | for Kawamoto's firm method | |
Hexane | wako | 080-03423 | for Kawamoto's firm method |
Super Cryomouting Medium type R2 | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Paraffin | Sakura Finetek | 781001A0107 | |
Histo-Clear | NDS | HS-200 | |
Calcein | DOJINDO | 340-00433 | |
Hematoxylin | wako | 131-09665 | |
Eosin | wako | 051-06515 |