Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.
Proteinler için bir heterolog sentezleme sistemi olarak Xenopus oosit birinci Gurdon ve diğerleri tarafından tarif edilmiştir. 1 ve yaygın olarak keşfinden beri kullanılan (Referanslar 2-3, ve oradaki referanslar). Yabancı kanal ifadesi için oosit çekici kılan bir özellik endojen iyon kanalları 4 kötü bolluğu. Bu ifade sistemi ligand-kapılı iyon kanalı, aralarında çok sayıda proteinlerin karakterizasyonu için yararlı olduğu kanıtlanmıştır.
GABA A Kara kurbağası cinsi oositlerinde reseptörleri ve bunların fonksiyonel karakterizasyonu sentezleme oosit, cRNA, foliküler hücre tabakası çıkarılması ve elektrofizyolojik deneyler hızlı çözüm değişikliklerle microinjections izolasyonu da dahil olmak üzere, burada anlatılmıştır. Işlemler bu laboratuarda 5,6 optimize edilmiş ve rutin 7-9 kullanılan olanlardan sapma bulundu. Geleneksel olarak, soyulmuş oositler hazırlanırRT'de yumurtalık loblar uzun bir kollajenaz muamelesi ve bu soyulmuş oosit ile mRNA ile microinjected edilir. Optimize edilmiş yöntemler kullanılarak, çeşitli membran proteinleri olarak ifade edilmiştir ve rekombinant GABA A reseptörleri 10-12, insan rekombinant klorür kanalları 13, tripanosom potasyum kanallarının 14 ve miyo -inositol taşıyıcı 15, 16 olduğu gibi, bu sistem ile incelenmiştir.
Burada ayrıntılı yöntemler, Xenopus oositlerde seçim herhangi bir proteinin ekspresyonu tatbik edilebilir, ve hızlı bir çözüm değişikliğin diğer ligand-kapılı iyon kanallarının incelemek için kullanılabilir.
Xenopus oositleri yaygın (- 3, ve oradaki referanslar Kaynaklar 2) bir ekspresyon sistemi olarak kullanılmaktadır. Onlar düzgün montaj ve plazma zarlarının içine fonksiyonel olarak aktif birden fazla alt proteinleri dahil edebiliyoruz. Bu sistemi kullanarak, fonksiyonel olarak, tek başına ya da başka proteinlerle birlikte zar proteinleri araştırılması mutasyon, kimerik ya da birleştirilmiş proteinlerin özelliklerini incelemek için, ve potansiyel ilaçların incelenmesi için mümkündür.
başka heterolog sentezleme sistemleri üzerinden oosit kullanmanın avantajları dev hücre kolay kullanım, yabancı genetik bilgi Banyo perfüzyonu ile oositin bir ortamda kolayca kontrol eksprese eden hücrelerin yüksek oranda ve membran potansiyelinin kontrolü, .
Bu ifade sisteminin dezavantajı birçok laboratuvarda 17-20 gözlenen mevsimsel çeşididir. Bu varyasyon nedeninet olmaktan çok uzaktır. Buna ek olarak, oosit kalitesi genellikle güçlü bir değişiklik gözlenmiştir. Geleneksel yöntemler 7-9 yumurtalık loblar izolasyonunu, bazı saat kollajenaz için yumurtalık lobların pozlama, soyulmuş oosit seçimi ve oosit mikroenjeksiyon dahil ettik. Burada, alternatif, hızlı prosedürlerin bir dizi bize oosit kalitesinde mevsimsel değişimi ve küçük farklılıklar ile 30 yılı aşkın için bu ifade sistemi ile çalışmak için izin olduğunu bildirildi.
Oosit izolasyonu, mikro enjeksiyon cRNA ile ve foliküler hücre tabakası çıkarılması için anlatılan tadil edilmiş ve geliştirilmiş yöntemler, Xenopus oosit içinde tercih edilen bir proteinin ekspresyonu için kullanılabilir. oositin etrafında orta hızlı çözeltisi değişiklikleri için çok basit bir yöntem, herhangi bir ligand-kapılı iyon kanalı ve taşıyıcıların çalışmaya uygulanabilir.
Bu makalede açıklanan yöntemler geleneksel 7-9 kullanılan sapma. 1 ila 2 saat kollajenaz muamelesi 8 yumurtalık lobları maruz standarttır; hasarsız, soyulmuş oosit izole; ve mRNA ticari enjeksiyon cihazlarını kullanarak bunları enjekte edin. Oositler, kollajenaz yüksek konsantrasyonda uzun maruz bırakılma ile zarar olması muhtemeldir 1): Klasik bir prosedür, aşağıdaki dezavantajları vardır. 2) kararsız soyulmuş oosit deney kadar saklanmalıdır. 3) Köreltilmiş oosit kökle…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Swiss National Science Foundation grant 315230_156929/1. M.C.M. is a recipient of a fellowship (Beca Chile Postdoctorado from CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).
NaCl | Sigma | 71380 | |
KCl | Sigma | P-9541 | |
NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
MgSO4 | Sigma | M-1880 | |
CaCl2 | Sigma | 223560 | |
Ca(NO3)2 | Sigma | C1396 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
Penicilin/streptomycin | Gibco | 15140-148 | 100 μg penicillin/ml and 100 μg streptomycin/ml |
Platinum wire loop | home-made | ||
Micropipette puller | Zeitz-Instruments GmBH | DMZ | |
Hamilton syringe | Hamilton | 80300 | 10 μl, Type 701N |
Thick walled polytetrafluoroethylene tubing | Labmarket GmBH | 1.0 mm OD | |
Paraffin oil | Sigma | 18512 | |
Nylon net, gauge 0.8 mm | ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG | ||
Borosilicate glass tube | Corning | 99445-12 | PYREX |
Collagenase NB Standard Grade | SERVA | 17454 | |
Trypsin inhibitor type I-S | Sigma | T-9003 | |
EGTA | Sigma | E3389 | |
Glass capillary | Jencons (Scientific ) LTD. | H15/10 | 1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited |
Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0019 | 1.0 OD X 0.58 ID X 100 Length mm (for microinjection) |
Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0044 | 1.2 OD X 0.69 ID X 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp) |
γ-Aminobutyric acid (GABA) | Sigma | A2129 | |
3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC) | Sigma | P2016 | |
grill motor | Faulhaber | DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2 | |
micrometer screw | Kiener-Wittlin | 10400 | TESA, AR 02.11201 |
Sterile plastic transfer pipettes | Saint-Amand Mfg. | 222-20S |