Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.
הביצית Xenopus כמערכת ביטוי Heterologous עבור חלבונים, תוארה לראשונה על ידי ואח Gurdon. 1 ו כבר בשימוש נרחב מאז גילויו (הפניות 2 – 3, והפניות בו). מאפיין זה הופך את הביצית אטרקטיבית לביטוי ערוץ הזר הוא שפע העניים של תעלות יונים אנדוגני 4. מערכת ביטוי זה הוכיח עצמו שימושי לאפיון של חלבונים רבים, ביניהם תעלות יונים מגודרת ליגנד.
הביטוי של קולטנים של GABA ב ביציות Xenopus והאפיון הפונקציונלי שלהם מתואר כאן, כולל הבידוד של ביציות, microinjections עם קרנה, הסרת שכבות תאי זקיקים, ושינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרו. הנהלים היו אופטימיזציה במעבדה זו 5,6 ו לסטות אלה בשימוש שגרתי 7-9. באופן מסורתי, ביציות ערומים ערוכותעם טיפול collagenase ממושך של אונות שחלה ב RT, וביציות הערומים האלה microinjected עם mRNA. באמצעות שיטות אופטימיזציה, חלבונים בממברנה מגוונים הובעו ולמד עם מערכת זו, כגון קולטנים של GABA רקומביננטי 10-12, תעלות כלוריד רקומביננטי אנושי 13, תעלות אשלגן Trypanosome 14, ו טרנספורטר מיו -inositol 15, 16.
השיטות המפורטות כאן ניתן להחיל את הביטוי של חלבון כלשהו של בחירה ב ביציות Xenopus, ושינוי הפתרון המהיר שניתן להשתמש בם כדי ללמוד תעלות יונים ליגנד מגודרת אחרות.
ביציות Xenopus נמצאים בשימוש נרחב כמערכת ביטוי (הפניות 2 – 3, והפניות בו). הם מסוגלים להרכיב כראוי לשלב חלבוני multisubunit פעילים מבחינה תפקודית לתוך ממברנות הפלזמה שלהם. באמצעות מערכת זו, ניתן לחקור חלבונים בממברנה תפקודי לבד או בשילוב עם חלבונים אחרים, כדי ללמוד את המאפיינים של מוטציה, כימרי, או חלבונים בשרשור, ו להקרין תרופות פוטנציאליות.
יתרונות שימוש ביציות פני מערכות ביטוי Heterologous אחרות נמנו טיפול פשוט של התאים הענקים, השיעור הגבוה של תאי מבטאי מידע גנטי זר, השליטה הפשוטה של הסביבה של הביצית באמצעות זלוף אמבטיה, ואת השליטה על פוטנציאל הממברנה .
החיסרון של מערכת ביטוי זה הוא התנודתיות העונתית שנצפתה במעבדות רבות 17-20. הסיבה וריאציה זורחוק מלהיות ברור. בנוסף, איכות ביציות הוא נצפה לעיתים קרובות כדי להשתנות מאוד. שיטות מסורתיות 7-9 כללו את הבידוד של אונות שחלה, החשיפה של אונות שחלה כדי collagenase עבור כמה שעות, הבחירה של ביציות ערומות, ואת microinjection הביצית. כאן, מספר החלופי, הנהלים מהר מדווח כי אפשר לנו לעבוד עם מערכת ביטוי זה במשך יותר מ -30 שנה ללא וריאציה עונתיות וריאציה מעט באיכות ביצית.
השיטות לשנות ולשפר אותו מתואר כאן עבור הבידוד של ביציות, microinjection עם קרנה, והסרה של שכבות תאי זקיקים ניתן להשתמש על מנת לתת ביטוי לכל חלבון רצוי, לפי בחירה, ביצית Xenopus. השיטה פשוטה מאוד לשינויי פתרון מהירים של המדיום סביב הביצית ניתן להחיל המחקר של כל ערוץ יון מגודר ליגנד של נישאים.
השיטות המתוארות במאמר זה לסטות אלה המשמשים באופן מסורתי 7-9. זהו תקן לחשוף את האונות של השחלה כדי טיפול collagenase 1 עד 2 h 8; לבודד ביציות ניזוק, חשופה; ולהזריק אותם עם ה- mRNA באמצעות התקני הזרקה מסחריים. הליך קלסי זו כולל את החסרונות הבאים: 1) ביציות צפויות להינזק על …
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Swiss National Science Foundation grant 315230_156929/1. M.C.M. is a recipient of a fellowship (Beca Chile Postdoctorado from CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).
NaCl | Sigma | 71380 | |
KCl | Sigma | P-9541 | |
NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
MgSO4 | Sigma | M-1880 | |
CaCl2 | Sigma | 223560 | |
Ca(NO3)2 | Sigma | C1396 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
Penicilin/streptomycin | Gibco | 15140-148 | 100 μg penicillin/ml and 100 μg streptomycin/ml |
Platinum wire loop | home-made | ||
Micropipette puller | Zeitz-Instruments GmBH | DMZ | |
Hamilton syringe | Hamilton | 80300 | 10 μl, Type 701N |
Thick walled polytetrafluoroethylene tubing | Labmarket GmBH | 1.0 mm OD | |
Paraffin oil | Sigma | 18512 | |
Nylon net, gauge 0.8 mm | ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG | ||
Borosilicate glass tube | Corning | 99445-12 | PYREX |
Collagenase NB Standard Grade | SERVA | 17454 | |
Trypsin inhibitor type I-S | Sigma | T-9003 | |
EGTA | Sigma | E3389 | |
Glass capillary | Jencons (Scientific ) LTD. | H15/10 | 1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited |
Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0019 | 1.0 OD X 0.58 ID X 100 Length mm (for microinjection) |
Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0044 | 1.2 OD X 0.69 ID X 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp) |
γ-Aminobutyric acid (GABA) | Sigma | A2129 | |
3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC) | Sigma | P2016 | |
grill motor | Faulhaber | DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2 | |
micrometer screw | Kiener-Wittlin | 10400 | TESA, AR 02.11201 |
Sterile plastic transfer pipettes | Saint-Amand Mfg. | 222-20S |