Summary

В Vivo Исследовании антимикробной Синяя Светотерапии для Полирезистентного Acinetobacter baumannii Ожог инфекции с помощью биолюминесценции визуализации

Published: April 28, 2017
doi:

Summary

Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.

Abstract

Ожог инфекция продолжает оставаться важной причиной заболеваемости и смертности. Растущее появление множественных лекарственной устойчивости (МЛ) бактерий привело к частым неудачам традиционного лечения антибиотиков. Альтернативные терапевтические срочно необходимы для борьбы с МЛ бактерий.

Инновационный подход, не антибиотик, противомикробный синий свет (ABL), показал многообещающую эффективность против МЛ-инфекции. Механизм действия ABL пока еще недостаточно хорошо изучен. Это обычно выдвинута гипотеза , что в природе эндогенных фотосенсибилизирующих хромофоров бактерий (например, железа , свободные порфирины, флавины и т.д.) возбуждается ABL, который в своей очереди , производит цитотоксические активные формы кислорода (ROS) через фотохимический процесс.

В отличие от другого света на основе антимикробного подхода, противомикробное фотодинамическая терапия (APDT), ABL терапия не требуют участия экзогенного photosensitizэ. Все, что нужно, чтобы вступить в силу является облучением синего света; Поэтому, это просто и недорого. В ABL рецепторы эндогенные клеточные фотосенсибилизаторов в бактериях, а не ДНК. Таким образом, ABL, как полагают, значительно менее генотоксичен к клеткам-хозяевам, чем ультрафиолетового-С (УФС) облучения, которое непосредственно вызывает повреждение ДНК в клетках-хозяевах.

В этой статье мы приводим протокол для оценки эффективности терапии ABL для MDR Acinetobacter baumannii инфекций в мышиной модели ожоговой травмы. При использовании сконструированного биолюминесцентном штамма, мы смогли неинвазивно контролировать степень заражения в режиме реального времени в живых животных. Этот метод также является эффективным инструментом для мониторинга пространственного распределения инфекций у животных.

Introduction

Ожог инфекции, которые часто сообщалось из – за термических повреждений кожных, по- прежнему является важной причиной заболеваемости и смертности 1. Управления ожоговых инфекций еще более скомпрометированы увеличивающегося появления множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) штаммов бактерий 2 в связи с массовым применением антибиотиков. Одним из важных MDR грамотрицательные бактерии Acinetobacter baumannii, который , как известно, связано с недавними боевыми ранами и устойчив к воздействию практически всех доступных антибиотиков 3. Наличие биопленок на травмированных очагах было сообщено 4, 5 и , как полагает, усугубить толерантность к антибиотикам и иммунной защите 6, 7, вызывая хронические инфекциям 8, 9. Таким образом, существует прессовог потребность в разработке альтернативных методов лечения. В недавно объявленной Национальной стратегии по борьбе с устойчивыми к антибиотикам бактерий, развитие альтернативных терапевтических антибиотикам было отмечено как действие со стороны правительства Соединенных Штатов 10.

Легкие на основе противомикробные подходы, как указано в названии, требует облучения светом с или без других агентов. Эти подходы включают в себя антимикробной фотодинамической терапии (APDT), ультрафиолет-С (УФС) облучение, и противомикробное синий свет (ABL). В предыдущих исследованиях, они показали многообещающую эффективность в уничтожении MDR бактериальных штаммов 11, 12, 13. Среди трех легких подходов , основанный, ABL привлекает все большее внимание в последние года из – за его собственные антибактериальные свойства без применения фотосенсибилизаторов 14. В COMPARисоном к APDT, ABL предполагает использование только света, в то время как APDT требует сочетания света и фотосенсибилизатора. Поэтому, ABL является простым и недорогим 14. По сравнению с УФС, ABL , как полагают , будет намного меньше цитотоксических и генотоксичен к клеткам – хозяевам 15.

Целью данного протокола является исследование эффективности ABL для лечения ожоговых инфекций , вызванных МЛУ А. baumannii в мышиной модели. Мы используем биолюминесцентные патогенные бактерии разрабатывать новые модели мышей ожоговых инфекций, которые позволяют неинвазивный мониторинг бактериальной нагрузки в режиме реального времени. По сравнению с традиционным методом отбора проб жидкости тела / ткани и последующего покрытия и колонии подсчета 16, этот метод дает точные результаты. Процесс отбора проб ткани может ввести другой источник погрешности эксперимента. Поскольку интенсивность свечения бактерий линейно пропорциональна соот- ветствоватьзапруживании бактериальных КОЕГО 17, мы можем измерить непосредственно выживание бактерий после определенной дозы облучения света. Контролируя бактериальной нагрузки в живых животных, получавших светолечение в режиме реального времени, кинетика бактериального убийства могут быть охарактеризованы с использованием значительно меньшего числа мышей.

Protocol

1. Подготовка бактериальной культуры Добавить 7,5 мл Brain Heart Infusion (BHI) среда к 50 мл центрифужной пробирки. Семенной А. baumannii клеток в среде BHI , а затем инкубировать А. baumannii культуры в орбитальном инкубаторе (37 ° С) в течение 18 часов. Центрифуга культуры клеток при 3500 х г в т?…

Representative Results

Штамм A. baumannii , что мы использовали это клинический изолят MDR, как сообщалось ранее 12, 17. Бактериальный штамм был сделан биолюминесцентным с помощью трансфекции luxCDABE оперы 11. Фигура 1А показывает последоват…

Discussion

ABL представляет собой новый способ лечения инфекций. Поскольку механизм действия полностью отличается от химиотерапии, более физиотерапии. Агент, который опосредует противомикробное действие синего света облучения (400-470 нм). С развитием синих светодиодов, мы получили доступ к эффекти?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported in part by the Center for Integration of Medicine and Innovative Technology (CIMIT) under the U.S. Army Medical Research Acquisition Activity Cooperative Agreement (CIMIT No. 14-1894 to TD) and the National Institutes of Health (1R21AI109172 to TD). YW was supported by an ASLMS Student Research Grant (BS.S02.15). We are grateful to Tayyaba Hasan, PhD at the Wellman Center for her co-mentorship for YW.

Materials

IVIS  PerkinElmer Inc, Waltham, MA IVIS Lumina Series III Pre-clinical in vivo imaging
Light-emitting diode LED VieLight Inc, Toronto, Canada  415 nm Light source for illumination
Power/energy meter Thorlabs, Inc., Newton, NJ PM100D Light irradiance detector
Mouse  Charles River Laboratories, Wilmington, MA BALB/c 7-8 weeks age, 17-19 g weight
Acinetobacter baumannii  Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX Clinical isolate Engineered luminescent strain
Insulin Syringes Fisher Scientific 14-826-79 BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection
Sodium Chloride Fisher Scientific 721016 0.9% Sodium Chloride
Phosphate Buffered Saline, 1X Solution Fisher Scientific BP24384  A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures
Brain Heart Infusion Fisher Scientific B11059 Bacterial culture medium
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C For bacterial suspension centrifuge
Benchtop Incubated Orbital Shakers Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH  Incu-Shaker Mini For culturing of bacteria
Inoculating Loops Fisher Scientific 22-363-605   For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice
Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200µL Fisher Scientific 02-707-502 Pipet Tips
Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge Fisher Scientific 75-004-220 For bacterial suspension seperation
Brass Block Small Parts, Inc., Miami, FL 10 mm by 10 mm  For creation of burns in mice
Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY PBI83514  Heat Resistant Gloves
Greiner dishes Sigma-Aldrich Co. LLC P5112-740EA 35 mm ×10 mm
Corning Digital Hot Plate Cole-Parmer Instrument Company, LLC UX-84301-65 10" x 10", 220 VAC, for boiling water 
Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed E-Z Systems EZ-211 Prevents heat loss and hypothermia during surgery

References

  1. Gibran, N. S. Summary of the 2012 ABA Burn Quality Consensus conference. J Burn Care Res. 34 (4), 361-385 (2013).
  2. Sommer, R., Joachim, I., Wagner, S., Titz, A. New approaches to control infections: anti-biofilm strategies against gram-negative bacteria. Chimia (Aarau). 67 (4), 286-290 (2013).
  3. Peleg, A. Y., Seifert, H., Paterson, D. L. Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen. Clin Microbiol Rev. 21 (3), 538-582 (2008).
  4. Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
  5. Schaber, J. A. Pseudomonas aeruginosa forms biofilms in acute infection independent of cell-to-cell signaling. Infect Immun. 75 (8), 3715-3721 (2007).
  6. Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int J Antimicrob Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
  7. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiol Mol Biol Rev. 78 (3), 510-543 (2014).
  8. Akers, K. S. Biofilms and persistent wound infections in United States military trauma patients: a case-control analysis. BMC Infect Dis. 14, 190 (2014).
  9. Burmolle, M., et al. Biofilms in chronic infections – a matter of opportunity – monospecies biofilms in multispecies infections. FEMS Immunol Med Microbiol. 59 (3), 324-336 (2010).
  10. . National strategy on combating antibiotic-resistant bacteria Available from: https://www.whitehouse.gov/sites/default/files/docs/carb_national_strategy.pdf (2014)
  11. Dai, T. Photodynamic therapy for Acinetobacter baumannii burn infections in mice. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3929-3934 (2009).
  12. Zhang, Y. Antimicrobial blue light therapy for multidrug-resistant Acinetobacter baumannii infection in a mouse burn model: implications for prophylaxis and treatment of combat-related wound infections. J Infect Dis. 209 (12), 1963-1971 (2014).
  13. Dai, T., et al. Ultraviolet C light for Acinetobacter baumannii wound infections in mice: potential use for battlefield wound decontamination?. J Trauma Acute Care Surg. 73 (3), 661-667 (2012).
  14. Dai, T. Blue light for infectious diseases: Propionibacterium acnes, Helicobacter pylori, and beyond?. Drug Resist Updat. 15 (4), 223-236 (2012).
  15. Yin, R. Light based anti-infectives: ultraviolet C irradiation, photodynamic therapy, blue light, and beyond. Curr Opin Pharmacol. 13 (5), 731-762 (2013).
  16. Haisma, E. M. Inflammatory and antimicrobial responses to methicillin-resistant Staphylococcus aureus in an in vitro wound infection model. PLoS One. 8 (12), e82800 (2013).
  17. Wang, Y. Antimicrobial Blue Light Inactivation of Gram-Negative Pathogens in Biofilms: In Vitro and In Vivo Studies. J Infect Dis. 213 (9), 1380-1387 (2016).
  18. Chen, D., Shen, Y., Huang, Z., Li, B., Xie, S. Light-Emitting Diode-Based Illumination System for In Vitro Photodynamic Therapy. Int J Photoenergy. 2012 (2), (2012).
  19. Demidova, T. N., Gad, F., Zahra, T., Francis, K. P., Hamblin, M. R. Monitoring photodynamic therapy of localized infections by bioluminescence imaging of genetically engineered bacteria. J Photochem Photobiol B. 81 (1), 15-25 (2005).
  20. Hamblin, M. R., Zahra, T., Contag, C. H., McManus, A. T., Hasan, T. Optical monitoring and treatment of potentially lethal wound infections in vivo. J Infect Dis. 187 (11), 1717-1725 (2003).
  21. Rowan, M. P. Burn wound healing and treatment: review and advancements. Critical Care. 19, 243 (2015).
  22. Marx, D. E., Barillo, D. J. Silver in medicine: The basic science. Burns. 40 (Supplement 1), S9-S18 (2014).
  23. Heyneman, A., Hoeksema, H., Vandekerckhove, D., Pirayesh, A., Monstrey, S. The role of silver sulphadiazine in the conservative treatment of partial thickness burn wounds: A systematic review. Burns. 42 (7), 1377-1386 (2016).
  24. Roberts, J. A. Individualised antibiotic dosing for patients who are critically ill: challenges and potential solutions. Lancet Infect Dis. 14 (6), 498-509 (2014).
  25. Dai, T. Blue light eliminates community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in infected mouse skin abrasions. Photomed Laser Surg. 31 (11), 531-538 (2013).
  26. Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
  27. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  28. Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2015).
  29. Song, H. H. Phototoxic effect of blue light on the planktonic and biofilm state of anaerobic periodontal pathogens. J Periodontal Implant Sci. 43 (2), 72-78 (2013).
  30. Rosa, L. P., da Silva, F. C., Viana, M. S., Meira, G. A. In vitro effectiveness of 455-nm blue LED to reduce the load of Staphylococcus aureus and Candida albicans biofilms in compact bone tissue. Lasers Med Sci. 31 (1), 27-32 (2015).
  31. Guffey, J. S., Wilborn, J. In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm blue light. Photomed Laser Surg. 24 (6), 684-688 (2006).
  32. Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro. Photomed Laser Surg. 27 (2), 221-226 (2009).
  33. Bumah, V. V., Masson-Meyers, D. S., Cashin, S. E., Enwemeka, C. S. Wavelength and bacterial density influence the bactericidal effect of blue light on methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Photomed Laser Surg. 31 (11), 547-553 (2013).
  34. Maclean, M., MacGregor, S. J., Anderson, J. G., Woolsey, G. Inactivation of bacterial pathogens following exposure to light from a 405-nanometer light-emitting diode array. Appl Environ Microbiol. 75 (7), 1932-1937 (2009).
  35. Kim, M. Optical lens-microneedle array for percutaneous light delivery. Biomedical Optics Express. 7 (1o), 4220-4227 (2016).

Play Video

Cite This Article
Wang, Y., Harrington, O. D., Wang, Y., Murray, C. K., Hamblin, M. R., Dai, T. In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (122), e54997, doi:10.3791/54997 (2017).

View Video