In vivo חקירת טיפול באור כחול אנטימיקרוביים multidrug עמידים baumannii Acinetobacter צרוב דלקות באמצעות הדמיה פליטת אור
Summary
Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.
Abstract
צרוב זיהומים ממשיכים להיות גורם חשוב לתחלואה ותמותה. הופיע גדלו וההולך של עמידים multidrug (MDR) חיידקים הובילו לכישלון התכוף של טיפולים אנטיביוטיים מסורתיים. תרופות אלטרנטיביות נדרשות בדחיפות כדי להתמודד עם חיידקי MDR.
גישה חדשנית הלא אנטיביוטי, אור כחול מיקרוביאלית (ABL), הוכיח יעילות מבטיחה נגד זיהומים MDR. מנגנון הפעולה של ABL עדיין לא הבין היטב. ההשערה היא כי בדרך כלל טבעי chromophores photosensitizing אנדוגני חיידקים (למשל, פורפירינים חופשי-ברזל, flavins, וכו ') הם נרגשים ABL, אשר בתורו מייצר מינים חמצן תגובתי ציטוטוקסיות (ROS) באמצעות תהליך פוטו.
בניגוד מבוסס אור אחר גישה מיקרוביאלית, טיפול פוטודינמי מיקרוביאלית (aPDT), טיפול ABL אינו מחייב המעורבות של photosensitiz אקסוגנייםאה. כל מה שהיא צריכה להיכנס לתוקף הוא הקרנה של אור כחול; ולכן, זה פשוט וזול. הקולטנים ABL הם הפוטוסנסיטייזרים הסלולר אנדוגני חיידקים, ולא את ה- DNA. לפיכך, הוא האמין ABL להיות הרבה פחות genotoxic לארח תאים מ אולטרה סגול-C (UVC) הקרנה, אשר באופן ישיר גורמת נזק לדנ"א בתאים המארח.
במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול להעריך את האפקטיביות של הטיפול ABL עבור זיהומים baumannii Acinetobacter MDR במודל של עכברים של פגיעה כוויה. באמצעות זן bioluminescent מהונדס, הצלחנו לעקוב אחר מידת הזיהום פולשנית בזמן אמת בחיות חיים. טכניקה זו היא גם כלי יעיל עבור ניטור הפריסה המרחבית של זיהומים אצל בעלי חיים.
Introduction
זיהומים צרובים, אשר מדווחים לעתים קרובות בגלל פציעות תרמית עורית, ממשיכים להיות גורם חשוב לתחלואה והתמותה 1. הנהלת זיהומי כוויית נפרץ נוספת על ידי הופעתה הגדלה וההולך של עמידים multidrug (MDR) זני חיידקי 2 עקב השימוש המסיבי של אנטיביוטיקה. MDR אחד חשוב גראם שליליים חיידקים הוא baumannii Acinetobacter, אשר ידוע להיות מזוהה עם פצעי הקרב האחרונות והוא עמיד כמעט לכל זמין אנטיביוטיקה 3. הנוכחות של biofilms במוקדי הפצוע דווחה 4, 5, והוא האמין להחריף את הסובלנות לאנטיביוטיקה ומארח הגנה 6, 7, גרימת זיהומים מתמשכים 8, 9. לכן, קיים pressing צריך לפיתוח טיפולים אלטרנטיביים. באסטרטגיה הלאומית הודיעה לאחרונה למאבק עמידים לאנטיביוטיקה חיידקים, פיתוח תרופות חלופיות לאנטיביוטיקה כבר ציין כפעולה על ידי ממשלת ארצות הברית 10.
אור מבוסס גישות אנטי-מיקרוביאלית, כפי שמלמדות השם, דורשות הקרנת אור עם או בלי סוכנים אחרים. גישות אלה כוללים טיפול פוטודינמי מיקרוביאלית (aPDT), סגול-C (UVC) הקרנה, ואור כחול מיקרוביאלית (ABL). במחקרים קודמים, הם הראו יעילים מבטיחים הרג זני MDR חיידקי 11, 12, 13. בין גישות אור מבוסס השלוש, ABL משך תשומת לב גוברת בשנים האחרונות עקב תכונות אנטיבקטריאליות הפנימיות שלה ללא שימוש הפוטוסנסיטייזרים 14. בשנת comparison כדי aPDT, ABL רק כרוך בשימוש באור, בעוד aPDT דורש שילוב של אור פוטוסנסיטייזר. לכן, ABL היא פשוטה וזולה 14. בהשוואה UVC, ABL הוא האמין להיות הרבה פחות ציטוטוקסיות genotoxic לארח תאים 15.
מטרת פרוטוקול זה היא לחקור את האפקטיביות של ABL לטיפול בזיהומים הנגרמים על ידי כוויה baumannii א MDR במודל של עכברים. אנו משתמשים חיידקים פתוגניים bioluminescent לפתח מודלים העכבר החדש של זיהומים כוויה המאפשרים ניטור פולשני של הנטל חיידקי בזמן אמת. לעומת השיטה המסורתית של דגימת גוף נוזלת / רקמות ציפוי עתידי מושבה לספור 16, טכניקה זו מספקת תוצאות מדויקות. תהליך דגימת רקמות יכול להציג מקור נוסף של שגיאה ניסיונית. מאז עוצמת הארת החיידקים היא מידתית באופן ליניארי corresponding חיידקי CFU 17, אנו יכולים למדוד את ההישרדות של החיידקים ישירות אחרי מנה מסוימת של הקרנת אור. על ידי ניטור ניטל חיידקי חיים וחיות קבלת טיפול האור בזמן אמת, קינטיקה של הרג חיידקים ניתן לאפיין באמצעות מספר מופחת משמעותי של עכברים.
Protocol
Representative Results
Discussion
ABL היא שיטה חדשנית לטיפול בזיהומים. מאז מנגנון הפעולה שלה שונה לחלוטין מזו של כימותרפיה, זה יותר של פיזיותרפיה. הסוכן המתווך את ההשפעה מיקרוביאלית הוא הקרנת אור כחול (400-470 ננומטר). עם ההתפתחות של נוריות כחולות, רכשנו גישת גישה מיקרוביאלית מבוסס אור יעילה ופשוט עבור זיה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Center for Integration of Medicine and Innovative Technology (CIMIT) under the U.S. Army Medical Research Acquisition Activity Cooperative Agreement (CIMIT No. 14-1894 to TD) and the National Institutes of Health (1R21AI109172 to TD). YW was supported by an ASLMS Student Research Grant (BS.S02.15). We are grateful to Tayyaba Hasan, PhD at the Wellman Center for her co-mentorship for YW.
Materials
| IVIS | PerkinElmer Inc, Waltham, MA | IVIS Lumina Series III | Pre-clinical in vivo imaging |
| Light-emitting diode LED | VieLight Inc, Toronto, Canada | 415 nm | Light source for illumination |
| Power/energy meter | Thorlabs, Inc., Newton, NJ | PM100D | Light irradiance detector |
| Mouse | Charles River Laboratories, Wilmington, MA | BALB/c | 7-8 weeks age, 17-19 g weight |
| Acinetobacter baumannii | Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX | Clinical isolate | Engineered luminescent strain |
| Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 721016 | 0.9% Sodium Chloride |
| Phosphate Buffered Saline, 1X Solution | Fisher Scientific | BP24384 | A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures |
| Brain Heart Infusion | Fisher Scientific | B11059 | Bacterial culture medium |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | For bacterial suspension centrifuge |
| Benchtop Incubated Orbital Shakers | Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH | Incu-Shaker Mini | For culturing of bacteria |
| Inoculating Loops | Fisher Scientific | 22-363-605 | For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice |
| Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200µL | Fisher Scientific | 02-707-502 | Pipet Tips |
| Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-220 | For bacterial suspension seperation |
| Brass Block | Small Parts, Inc., Miami, FL | 10 mm by 10 mm | For creation of burns in mice |
| Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves | Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY | PBI83514 | Heat Resistant Gloves |
| Greiner dishes | Sigma-Aldrich Co. LLC | P5112-740EA | 35 mm ×10 mm |
| Corning Digital Hot Plate | Cole-Parmer Instrument Company, LLC | UX-84301-65 | 10" x 10", 220 VAC, for boiling water |
| Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed | E-Z Systems | EZ-211 | Prevents heat loss and hypothermia during surgery |
References
- Gibran, N. S. Summary of the 2012 ABA Burn Quality Consensus conference. J Burn Care Res. 34 (4), 361-385 (2013).
- Sommer, R., Joachim, I., Wagner, S., Titz, A. New approaches to control infections: anti-biofilm strategies against gram-negative bacteria. Chimia (Aarau). 67 (4), 286-290 (2013).
- Peleg, A. Y., Seifert, H., Paterson, D. L. Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen. Clin Microbiol Rev. 21 (3), 538-582 (2008).
- Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
- Schaber, J. A. Pseudomonas aeruginosa forms biofilms in acute infection independent of cell-to-cell signaling. Infect Immun. 75 (8), 3715-3721 (2007).
- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int J Antimicrob Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
- Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiol Mol Biol Rev. 78 (3), 510-543 (2014).
- Akers, K. S. Biofilms and persistent wound infections in United States military trauma patients: a case-control analysis. BMC Infect Dis. 14, 190 (2014).
- Burmolle, M., et al. Biofilms in chronic infections – a matter of opportunity – monospecies biofilms in multispecies infections. FEMS Immunol Med Microbiol. 59 (3), 324-336 (2010).
- . National strategy on combating antibiotic-resistant bacteria Available from: https://www.whitehouse.gov/sites/default/files/docs/carb_national_strategy.pdf (2014)
- Dai, T. Photodynamic therapy for Acinetobacter baumannii burn infections in mice. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3929-3934 (2009).
- Zhang, Y. Antimicrobial blue light therapy for multidrug-resistant Acinetobacter baumannii infection in a mouse burn model: implications for prophylaxis and treatment of combat-related wound infections. J Infect Dis. 209 (12), 1963-1971 (2014).
- Dai, T., et al. Ultraviolet C light for Acinetobacter baumannii wound infections in mice: potential use for battlefield wound decontamination?. J Trauma Acute Care Surg. 73 (3), 661-667 (2012).
- Dai, T. Blue light for infectious diseases: Propionibacterium acnes, Helicobacter pylori, and beyond?. Drug Resist Updat. 15 (4), 223-236 (2012).
- Yin, R. Light based anti-infectives: ultraviolet C irradiation, photodynamic therapy, blue light, and beyond. Curr Opin Pharmacol. 13 (5), 731-762 (2013).
- Haisma, E. M. Inflammatory and antimicrobial responses to methicillin-resistant Staphylococcus aureus in an in vitro wound infection model. PLoS One. 8 (12), e82800 (2013).
- Wang, Y. Antimicrobial Blue Light Inactivation of Gram-Negative Pathogens in Biofilms: In Vitro and In Vivo Studies. J Infect Dis. 213 (9), 1380-1387 (2016).
- Chen, D., Shen, Y., Huang, Z., Li, B., Xie, S. Light-Emitting Diode-Based Illumination System for In Vitro Photodynamic Therapy. Int J Photoenergy. 2012 (2), (2012).
- Demidova, T. N., Gad, F., Zahra, T., Francis, K. P., Hamblin, M. R. Monitoring photodynamic therapy of localized infections by bioluminescence imaging of genetically engineered bacteria. J Photochem Photobiol B. 81 (1), 15-25 (2005).
- Hamblin, M. R., Zahra, T., Contag, C. H., McManus, A. T., Hasan, T. Optical monitoring and treatment of potentially lethal wound infections in vivo. J Infect Dis. 187 (11), 1717-1725 (2003).
- Rowan, M. P. Burn wound healing and treatment: review and advancements. Critical Care. 19, 243 (2015).
- Marx, D. E., Barillo, D. J. Silver in medicine: The basic science. Burns. 40 (Supplement 1), S9-S18 (2014).
- Heyneman, A., Hoeksema, H., Vandekerckhove, D., Pirayesh, A., Monstrey, S. The role of silver sulphadiazine in the conservative treatment of partial thickness burn wounds: A systematic review. Burns. 42 (7), 1377-1386 (2016).
- Roberts, J. A. Individualised antibiotic dosing for patients who are critically ill: challenges and potential solutions. Lancet Infect Dis. 14 (6), 498-509 (2014).
- Dai, T. Blue light eliminates community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in infected mouse skin abrasions. Photomed Laser Surg. 31 (11), 531-538 (2013).
- Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
- Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2015).
- Song, H. H. Phototoxic effect of blue light on the planktonic and biofilm state of anaerobic periodontal pathogens. J Periodontal Implant Sci. 43 (2), 72-78 (2013).
- Rosa, L. P., da Silva, F. C., Viana, M. S., Meira, G. A. In vitro effectiveness of 455-nm blue LED to reduce the load of Staphylococcus aureus and Candida albicans biofilms in compact bone tissue. Lasers Med Sci. 31 (1), 27-32 (2015).
- Guffey, J. S., Wilborn, J. In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm blue light. Photomed Laser Surg. 24 (6), 684-688 (2006).
- Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro. Photomed Laser Surg. 27 (2), 221-226 (2009).
- Bumah, V. V., Masson-Meyers, D. S., Cashin, S. E., Enwemeka, C. S. Wavelength and bacterial density influence the bactericidal effect of blue light on methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Photomed Laser Surg. 31 (11), 547-553 (2013).
- Maclean, M., MacGregor, S. J., Anderson, J. G., Woolsey, G. Inactivation of bacterial pathogens following exposure to light from a 405-nanometer light-emitting diode array. Appl Environ Microbiol. 75 (7), 1932-1937 (2009).
- Kim, M. Optical lens-microneedle array for percutaneous light delivery. Biomedical Optics Express. 7 (1o), 4220-4227 (2016).
