In Vivo Investigation of Antimicrobial Therapy luz azul para-multirresistente Acinetobacter baumannii queimadura Infecções Usando bioluminescência Imagiologia

Summary

Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.

Abstract

Queime infecções continuam a ser uma importante causa de morbidade e mortalidade. O aparecimento crescente de bactérias resistentes a múltiplas drogas (MDR) levou à falha frequente de tratamentos com antibióticos tradicionais. alternativas terapêuticas são urgentemente necessários para combater bactérias MDR.

Uma abordagem não-antibiótico inovador, luz azul antimicrobiana (ABL), demonstrou eficácia promissora contra infecções MDR. O mecanismo de acção de Abl não é ainda bem compreendido. É geralmente formulada a hipótese de que ocorre naturalmente cromóforos endógenos fotossensibilizantes em bactérias (por exemplo, porfirinas de ferro livre, as flavinas, etc.) são excitados por Abl, que por sua vez produz citotóxicos espécies reactivas de oxigénio (ROS) através de um processo fotoquímico.

Ao contrário de uma outra abordagem antimicrobiana à base de luz, antimicrobiana terapia fotodinâmica (APDT), terapia Abl não requer o envolvimento de um photosensitiz exógenoer. Tudo que precisa para entrar em vigor é a irradiação de luz azul; por conseguinte, é simples e barata. Os receptores ABL são os fotossensibilizadores celulares endógenos em bactérias, em vez do ADN. Assim, Abl acredita-se ser muito menos genotóxico para as células do que a irradiação ultravioleta C (UVC), o que provoca danos no DNA directamente nas células hospedeiras hospedeiras.

Neste artigo, apresentamos um protocolo para avaliar a eficácia da terapia de ABL para MDR Acinetobacter baumannii infecções em um mouse modelo de queimaduras. Usando uma cepa bioluminescente engenharia, fomos capazes de monitorar de forma não invasiva a extensão da infecção em tempo real em animais vivos. Esta técnica é também uma ferramenta eficaz para o controlo da distribuição espacial de infecções em animais.

Introduction

Queimam infecções, que são frequentemente referidas por causa de lesões térmicas cutâneas, continuam a ser uma causa importante de morbidade e mortalidade ^1. O tratamento de infecções da queimadura foi ainda mais comprometida pelo aumento da emergência de (MDR) ² estirpes bacterianas resistentes a múltiplas drogas, devido ao uso de antibióticos. Uma bactéria Gram-negativas MDR importantes é Acinetobacter baumannii, que é conhecida por estar associada com feridas de batalha recentes e é resistente a quase todos os antibióticos disponíveis ^3. A presença de biofilmes na focos ferida foi avaliado ^{4, 5} e acredita-se que exacerbam a tolerância a antibióticos e a defesa do hospedeiro ^{6, 7,} causando infecções persistentes ^{8, 9.} Portanto, há uma pressing preciso para o desenvolvimento de tratamentos alternativos. Na Estratégia Nacional recentemente anunciado de Combate às bactérias resistentes aos antibióticos, o desenvolvimento de terapias alternativas aos antibióticos tem sido observado como uma ação por parte do governo dos Estados Unidos ^10.

abordagens antimicrobianas à base de luz, como indicado pelo seu nome, requerem irradiação de luz com ou sem outros agentes. Estas abordagens incluem a terapia antimicrobiana fotodinâmica (APDT), ultravioleta C (UVC) irradiação, e luz azul antimicrobiana (Abl). Em estudos anteriores, que demonstraram eficácia em matar promissor MDR estirpes bacterianas ^{11, 12, 13.} Entre as três abordagens à base de luz, a ABL tem atraído cada vez mais atenção nos últimos anos devido às suas propriedades antibacterianas intrínsecas sem o uso de fotossensibilizantes ^14. em comparIson para APDT, Abl envolve apenas o uso de luz, enquanto APDT requer uma combinação de luz e um fotossensibilizador. Portanto, Abl é simples e de baixo custo ^14. Em comparação com UVC, Abl acredita-se ser muito menos citotóxico e genotóxico para células ¹⁵ hospedeiras.

O objetivo deste protocolo é investigar a eficácia da ABL para o tratamento de infecções de queimaduras causadas por MDR A. baumannii em um modelo de mouse. Nós usamos bactérias patogênicas bioluminescentes para desenvolver novos modelos de ratos de infecções de queimaduras que permitem o monitoramento não-invasivo da carga bacteriana em tempo real. Em comparação com o método tradicional de recolha de amostras de fluido corporal / tecido e plaqueamento subsequente e colónia de contagem ^16, esta técnica fornece resultados precisos. O processo de amostragem de tecidos pode apresentar uma outra fonte de erro experimental. Desde a intensidade da luminescência bacteriana é linearmente proporcional à corresponding bacteriana CFU ^17, podemos medir directamente a sobrevivência de bactérias depois de uma certa dose de irradiação de luz. Ao monitorizar a carga bacteriana em animais vivos receber o tratamento com luz, em tempo real, a cinética da morte bacteriana pode ser caracterizado utilizando um número significativamente reduzido de ratinhos.

Protocol

1. Preparação de Cultura Bacteriana Adicionar 7,5 mL de Brain Heart Infusion (BHI) meio para um tubo de centrífuga de 50 mL. Semente células A. baumannii no meio BHI e então incubar a cultura de A. baumannii numa incubadora orbital (37 ° C) durante 18 h. Centrifugar a cultura de células a 3500 x g durante 5 minutos, remover o sobrenadante, e lavar os sedimentos em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Re-suspender as pelotas de bactérias em PBS fresco e pi…

Representative Results

A estirpe de A. baumannii que é usado um isolado clínico MDR, como relatado previamente 12, 17. A estirpe bacteriana foi feita bioluminescente pela transfecção de luxCDABE ópera 11. A Figura 1A mostra as sucessivas imagens de luminescência bacteriana de um rato representativo queimar infectado com 5 x 10 6 A. baumannii e exposto a uma única expo…

Discussion

Abl é um novo método para o tratamento de infecções. Desde o seu mecanismo de ação é completamente diferente da de quimioterapia, é mais de uma fisioterapia. O agente que medeia o efeito antimicrobiano é a irradiação de luz azul (400-470 nm). Com o desenvolvimento de LEDs azuis, ganhamos acesso a uma abordagem antimicrobiano à base de luz simples e eficaz para infecções MDR.

Neste protocolo, descrevemos o desenvolvimento de um modelo de rato de infecções de queimaduras causad…

Materials

IVIS	PerkinElmer Inc, Waltham, MA	IVIS Lumina Series III	Pre-clinical in vivo imaging
Light-emitting diode LED	VieLight Inc, Toronto, Canada	415 nm	Light source for illumination
Power/energy meter	Thorlabs, Inc., Newton, NJ	PM100D	Light irradiance detector
Mouse	Charles River Laboratories, Wilmington, MA	BALB/c	7-8 weeks age, 17-19 g weight
Acinetobacter baumannii	Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX	Clinical isolate	Engineered luminescent strain
Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-826-79	BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection
Sodium Chloride	Fisher Scientific	721016	0.9% Sodium Chloride
Phosphate Buffered Saline, 1X Solution	Fisher Scientific	BP24384	A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures
Brain Heart Infusion	Fisher Scientific	B11059	Bacterial culture medium
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-70C	For bacterial suspension centrifuge
Benchtop Incubated Orbital Shakers	Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH	Incu-Shaker Mini	For culturing of bacteria
Inoculating Loops	Fisher Scientific	22-363-605	For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice
Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200µL	Fisher Scientific	02-707-502	Pipet Tips
Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-220	For bacterial suspension seperation
Brass Block	Small Parts, Inc., Miami, FL	10 mm by 10 mm	For creation of burns in mice
Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves	Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY	PBI83514	Heat Resistant Gloves
Greiner dishes	Sigma-Aldrich Co. LLC	P5112-740EA	35 mm ×10 mm
Corning Digital Hot Plate	Cole-Parmer Instrument Company, LLC	UX-84301-65	10" x 10", 220 VAC, for boiling water
Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed	E-Z Systems	EZ-211	Prevents heat loss and hypothermia during surgery