ACT-PRESTO (장기에 거대 분자의 활성 명확하게 기술 압력과 관련된 효율적이고 안정적인 전송) 수동 확산 또는 압력 보조 배달에 의해 삭제 조직으로, 신속하게 효율적으로하지만, 저렴한 조직 청소 및 신속한 항체 침투 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여, 조직의 넓은 범위는 다중 항체 클리어하여 immunolabeled 및 볼륨 – 이미징 될 수있다.
식별 및 장기 또는 세포 수준에서 몸 전체의 세부 조직의 탐구는 생물학의 근본적인 문제입니다. 천이 방법은 프로세스의 각 단계에서 정보의 손실이 발생 상당한 시간 및 3 차원 영상을 얻기위한 노력의 양, 본래 조직 절편 immunolabeling 포함 이미징 직렬 단면 조직을 필요로한다. 손상 조직 내에 고해상도 영상에 대한 최근 개발 된 방법에서, 분자의 특성은 단백질의 표지로 제한되었다. 그러나 장기 청산 현재 사용 가능한 프로토콜은 어려운 실험실에서 조직 정화 기술을 구현하고, 상당히 긴 처리 시간을 필요로한다. 우리는 최근에 신속하고 높은 재현성 프로토콜은 ACT-PRESTO로 명명 설립 (A 뽑은 C larity의 t echnique- P는 ressure의 r은 전자 fficient와의 테이블 t의를 ransfer을 의기 양양몇 시간 내에 조직 통관을 허용 오 rgans)에 고분자의. 또한, ACT-PRESTO은 기존의 방법과 빠른 immunolabeling을 가능하게하고 압력 또는 대류 흐름을 적용하여 조밀하게 형성, 두께 시편의 깊은 층으로 항체 침투를 가속화합니다. 우리는 전기를 사용하여 지방 제거에 의해 삭제하는 방법 조직을 준비하는 방법에 대해 설명하고, 방법을 압력 보조 전달하여 면역 염색. 프로토콜의 신속성과 일관성 차원 조직 학적 연구 볼륨 기반 진단 성능을 촉진한다.
신경에서의 과제 중 하나는 신경 회로 배선 그대로 뇌 조직 내의 개별 세포의 가시화된다. 최근까지, 이러한 방법으로 뉴런 간의 연결을 보여주는 조직은 1) 직렬 절편 요구; 이러한 축삭 또는 단백질과 같은 특정 대상, 2) 분자 표지; 전산 등록 또는 2D 직렬 이미지 1의 정렬을 통해 전체 뇌의 3 차원 복원에 의한 3) 시각화. 이 단계에서는, 번잡 많은 시간이 필요하며, 신경 네트워크 매핑 대단히 어렵게 절편 라벨링 동안에 정보가 손실되기 쉽다. 그러나, 단면 처리없이 그대로 조직의 시각화 할 수있는 여러 방법이 개발되어왔다. 생물 조직은 조직 청산 기술 2-10에 의해 광학적으로 투명하게 할 수있다. 주요 방법 중 하나가 손상 조직 차례로 침지 액의 굴절률 차이를 감소시키는따라서 투명한 조직을 렌더링 깊은 구조의 관찰을 가능하게 본래 조직에 광 산란을 감소시킨다. 침지 용액의 일부 유형의 탈수 과정에서 빠른 형광 소광 될 소수성을 갖는다. 따라서, 이러한 방법은 시간이 11, 12의 긴 기간 동안 형광 이미징와 호환되지 않습니다. 대신 소수성 시약, 다른 방법은 생체 조직의 4,6,8의 구조적 정보와 형광을 유지하는 등 SeeDB 4 무서 리터 전자 (6)와 같은 조직 청산을위한 친수성 시약을 사용합니다. 그러나, 거대 분자는 항체를 포함 형 확산에 의해 손상 조직의 중심에 도달 할 수 없다. 따라서, 밀집된 조직의 깊은 영역에서 표적 분자의 미리 라벨링 기술적 도전이다.
최근 개발 조직 소거 방법에있어서, CLARITY 3 하이드로 겔 포함 생체 조직의 전아크릴 아마이드 형성 S 및 지질 도데 실 황산나트륨 (SDS) 함유 용액 하에서 전기 영동에 의해 제거된다. 샘플은 다음 3 광 산란을 감소시키는 정합 굴절률과 용액에 침지된다. 지질 제거 시스템은 나중에 고급 CLARITY (13)와 PACT (수동 명확하게 기술) (10)에 수정되었습니다. 중합 종료 후, 아크릴 사슬은 하이드로 겔을 형성하는 조직, 단백질 가교. 아크릴 아미드와 가교 할 수 없습니다 지질 구성 요소; 따라서, 지질은 SDS 함유 완충액에 따라 전기 영동에 의해 제거 될 수있다. 지질의 활성 제거를 통해 뇌 조직 현저 투명성 9 증가시킨다. 그러나 이러한 방법은 자유 확산에 의해 깊은 라벨의 불가능을 해결하지 않습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 두꺼운 조직의 가장 깊은 부분에 시약의 활성 전송에 대한 기술이 필요하다.
CLARITY 조직의 청산과 깊은 조직을 수 있지만시각화, 그것은 쉽게 또는 빠르게 절차 아니다. 그것은 전체 마우스 뇌 7, 14을 취소 몇 주가 걸릴 수 있습니다. 조직의 신속한 소거 생명 과학 연구 나 볼륨 진단용 기본적인 임상 실험실 설정 이러한 방법의 적용을 위해 필수적이다. 현재의 프로토콜은 압력을 이용한 배달 면역 염색에 의해 생체 조직 통관 이후의 단백질 검출을위한 간단한 방법을 제공한다. 이 촬상 방법과 조합에 의해 출원 된 많은 3 차원 데이터 처리 시스템의 고해상도 볼륨 촬상에 적합하다.
조직에 좋지 고정 또는 하이드로 겔 침수는 단백질의 손실과 조직의 청산 과정에서 조직의 왜곡을 일으킬 수 있습니다. 부드러운 흔들림 18 H – 전체 성인 마우스 뇌 12 겔 단량체 용액을 20 ㎖의 최소 부피에 침지 한 후, 하룻밤 동안 4 % 파라 포름 알데히드에서 배양한다. 뇌 슬라이스와 척수 등의 인체 조직을 포함하여 대규모 조직의 경우, 요구되는 하이드로 겔 단량체 용액에서 시간을 몸을 담글 확장했다. 조직 고정 및 폴리머 주입 단계가 분리되어 있기 때문에 ACT 프로토콜은 고정 된 조직의 청산에 쉽게 적용 할 수있다. 조직 클리어 한 후, 인체 조직은 여러 항체로 잘 염색 하였다. 법 개간 기술은 에탄올과 메탄올 등 알코올 고정 제와 호환되지 않습니다.
조직 – 겔 중합 단계도 클리어 가공 후의 양질 조직을 제조하는 것이 중요하다. 때문에산소 아크릴 아미드의 중합 반응을 억제이를 질소 가스 주입 시스템 하에서 조직 – 함유 용액을 탈기에 의해 제거되어야한다. 다르게는, 탈 산소 23 시간 동안 가열 블록 진공 챔버를 사용하여 실행될 수있다.
지우기 속도는 대부분의 성인 마우스 조직 하룻밤 ETC에 의해 삭제 될 수 등 기관의 크기, 지질 또는 ECM 섬유 단백질의 내용, 고정의 상태 등 다양한 요인에 따라 달라집니다. 그러나의 위험이 불필요한 과잉 소거 및 조직 부종; 따라서, 청소 시간의 차이가 중요한 고려 사항으로합니다. 조직 청산 조건은 경험적으로 결정되어야한다. 중요하게는, ECM의 내용이 클리어 조직의 외관에 영향을 미칠 수있다. ACT는 고밀도 단백질 섬유를 취소하지 않기 때문에 조직의 색상, 심지어 ETC 버퍼의 ACT 후, 흰색 또는 불투명 남아있다. 그러나, 이러한 기관은 RI 정합 용액에 침지하여 상기y를 투명하게되었다.
조직의 팽창 속도는 밀도 기관보다 더 큰 팽창 비율을 전시, 전자 재료 조직의 내용 및 뇌 소프트 기관에 의존 할 것으로 보인다. 증가 된 조직은 조직 청산 절차를 도움이 될 것입니다 붓기 때문에, ACT는 정기적으로 대부분의 경우 수성 버퍼를 증류하여 사용한다. 조직 부종 또는 과도 변형은 배아 같이 바람직되지 않는 경우에, 버퍼 함유 0.1X PBS는 고해상도 영상에 대해 적용 할 수있다. 또한 버퍼의 높은 염 농도는 조직의 수축을 일으킬 수 있다는 것을 주목해야한다.
행위 방법은 마우스 (14)의 전체 기관, 심지어 몸 전체를 명확히 할 수 있습니다. 그러나, 투명 조직의 깊은 조직 이미징은 특수 현미경과 목표를 필요로한다. 따라서, 두꺼운 뇌 조직 1 – 2 mm는 종래의 공 초점 현미경 이미징을위한 가장 효과적입니다. 라벨의 우리의 손에, 제거ACT-처리 조직에서 에드 항체는 항체 의존적이며, 다른 항체 라벨의 라운드는 권장되지 않습니다. 이러한 TH 및 GFAP 등 여러 항체는, 전체 뇌 14 immunolabeling 특히 잘했다. 한편, 이러한 Tuj1 Map2에 또는 일부 항체는 종종 조직의 표면을 표지. 이것은 스위치 (15)와 같은 다른 방법에 의해 개선 될 수있다. 또 다른 잠재적 인 한계가 있기 때문에, 조직이 조직 지우는 단계 동안 팽창 및 수축의 ACT 처리 된 조직에서 미세 단백질 구조를 유지하기 어려울 수도 있다는 것이다.
프레스토 기술은 조직 라벨링 다양한 기술에 적용 가능하다. 예를 들어, SeeDB 4 iDISCO 7로 미리 라벨링 조직을 사용하여 조직 투명한 방법으로, 조밀 한 조직의 immunolabeling는 주에 몇 일 이상 배양 기간이 필요합니다. 그러나 PRESTO 몇 시간 배양 시간을 단축 할 수 있고, 예를1-mm 두께의 치밀한 조직을 갖는 일 이내에 전체 프로세스의 완료를 nabling. PRESTO 두꺼운 깊은 라벨, 조밀 한 조직, 또는 해제 해제 두꺼운 조직의 효율성을 향상시킬 수 있습니다. PRESTO 테이블 탑 원심 분리기 나 주사기 펌프를 사용하며 특별한 장비를 필요로하지 않기 때문에, 일상적인 실험 방법과이 방법을 구현하기 위해 상대적으로 용이하다.
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).
4% Paraformaldehyde | Lugen SCI | LGB-1175-4B | sample fixation |
Acrylamide | Affymetrix | 75820 | Hydrogel monomer solution |
2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries | VA-044 | Hydrogel monomer solution |
Boric acid | Affymetrix | 76324 | ETC buffer |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 18220 | ETC buffer |
Sodium hydroxide pellets | Junsei chemical | 1310-73-2 | ETC buffer |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323A | Immunolabeling |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Immunolabeling |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Immunolabeling |
Collagen type Ⅳ | Abcam | AB6586 | Antibody/immunolabeling |
Tyrosine hydroxylase (TH) | Millipore | AB152 | Antibody/immunolabeling |
Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | Secondary antibody/ immunolabeling |
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Life Technologies – Molecular Probes | A21206 | Secondary antibody/ immunolabeling |
Confocal dish | SPL lifesciences | 101350 | Imaging |
Confocal microscope | Leica | SP8 | Imaging |
Sucrose | Junsei chemical | 31365-0301 | CUBIC-mount solution |
Urea | Affymetrix | 23036 | CUBIC-mount solution |
N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine | Sigma-Aldrich | 122262 | CUBIC-mount solution |
ECT chamber | Logos Biosystems, Inc. | C10101 | ETC system |
ECT chamber controller | Logos Biosystems, Inc. | C10201 | ETC system |
Temperature probe | Logos Biosystems, Inc. | C12101 | ETC system |
Peristatic pump | Baoding longer precision pump Co., Ltd | YZ1515X | ETC system |
Buffer reservoir | Logos Biosystems, Inc. | C10401 | ETC system |
Tissue container | Logos Biosystems, Inc. | C12001 | ETC system |
Container holder for 1 tissue container | Logos Biosystems, Inc. | C12002 | ETC system |
Mouse brain slice holder | Logos Biosystems, Inc. | C12004 | ETC system |
Whole rat brain holder | Logos Biosystems, Inc. | C12007 | ETC system |
Peristaltic pump tubing | Logos Biosystems, Inc. | C12104 | ETC system |
Tabletop-centrifuge | Hanil science industrial Co., Ltd | MICRO 12 | c-PRESTO |
Syringe pump | Baoding longer precision pump Co., Ltd | LSP02-1B | s-PRESTO |
Syringe (20 ml) | Korea vaccine Co., Ltd. | KV-S20 | s-PRESTO |
3-way stopcock | Hyupsung medical Co.,Ltd. | HS-T-01N | s-PRESTO |