ACT-PRESTO(大分子活性清晰度技术压力相关的有效和稳定的转印到器官)实现快速,高效,但廉价的组织清算和快速抗体渗透到通过被动扩散或压力辅助输送清除组织。使用这种方法,广泛的组织中可以清除,由多个抗体免疫标记,和体积成像。
识别和器官或细胞水平全身的具体组织的探索是生物学的基本挑战。过渡方法需要的时间和努力来获得3D图像的大量和包括切片的完整组织,免疫标记和成像串联切片组织,这在过程的每一步产生的信息的损失。在完整的组织内的高分辨率成像最近开发的方法,分子特征已经被限制蛋白质的标签。然而,对于器官结算现有协议需要相当长的处理时间,使得难以实现在实验室组织交换技术。我们最近成立了一个快速和高重复性的协议被称为ACT-PRESTO( 一莫如çlarity 牛逼 echnique- p ressureř扬眉吐气Ëfficient和s表T转让(BOT)大分子转换为o rgans),允许在数小时内组织间隙。此外,ACT-PRESTO能够快速免疫标记与传统方法和通过施加压力或对流加速抗体渗入密集成形的,厚的样品的深层。我们描述了如何准备组织,如何通过脂质去除使用电泳清除,并通过压力辅助分娩如何免疫染色。该协议的快速性和一致性,将加快3D的组织学研究和基于卷的诊断性能。
一个在神经科学挑战是神经元电路布线和完整的脑组织内各个单元的可视化。直到最近,这表明这样的神经元之间的连接需要1)组织连续切片; 2)具体的目标,如轴突或蛋白质分子标记;和3)通过经由计算登记或2D序列图像1的对准三维重建整个大脑的可视化。这些步骤是费力的,需要大量时间,并且容易切片和标签,使神经网络映射非常困难的过程中丢失信息。然而,许多方法,允许对完整的组织,而不切片的可视化得到了发展。生物组织可以通过组织清除技术2-10进行光学透明的。其中一个主要的方法是减少完整的组织,并且为了浸渍溶液之间的折射率差异以减少在完整的组织的光散射,从而使该组织透明和有利的深层结构的观察。某些类型的浸没溶液的具有疏水性能,其脱水过程中导致快速荧光猝灭。因此,这些方法都没有超过的时间11,12长时间荧光成像相容。代替疏水试剂,其他方法用于组织清算亲水试剂例如SeeDB 4和SCA L E 6,其保持生物组织4,6,8的结构信息和荧光。但是,大分子,包括抗体,不能由扩散单独达到完整的组织的核心。因此,在密集的包装组织深区域目标分子的预标记在技术上具有挑战性。
在最近开发的组织清除的方法,CLARITY 3,水凝胶包埋生物组织我s的丙烯酰胺形成,和类脂物通过电泳下十二烷基硫酸钠(SDS)的含液中除去。然后将样品浸入与匹配折射率的溶液,以减少光散射3。脂质清除系统先进CLARITY 13和PACT(被动清晰技术)10后来被修改。聚合后,丙烯酰胺链交联与蛋白质,形成水凝胶的组织。脂质组分不能与丙烯酰胺交联;因此,脂质可以通过电泳的含有SDS的缓冲液下消除。通过积极消除血脂,脑组织明显增加透明度9。然而,这些方法不被自由扩散处理深标签是不可能的。为了克服这一限制,需要用于试剂的主动运输成厚组织的最深部分的技术。
虽然CLARITY允许组织清算和深层组织可视化,这不是一个容易或快速的过程。它可能需要几个星期来清除整个鼠脑7,14。组织快速清除是这样的方法,为生命科学研究或体积诊断基础或临床实验室设置的应用程序是必不可少的。目前的协议通过加压辅助分娩免疫染色为生物组织间隙和随后的蛋白质检测的简化过程。它适用于通过与成像方法组合大日提交的三维数据处理系统的高分辨率体积成像。
差固定或水凝胶浸入到组织可导致蛋白的损失和组织中的组织结算处理的失真。整个成年小鼠脑应在4%的多聚甲醛孵育过夜,然后浸没在20毫升12水凝胶单体溶液的最小体积 – 轻轻摇动18小时。对于大的组织中,包括人体组织,如脑切片和脊髓,扩展需要在水凝胶单体溶液中浸泡的时间。因为组织固定和聚合物注入步骤分开的ACT协议是很容易适用于固定的组织的清算。组织清理后,人体组织进行精心染色与几个抗体。需要注意的是对ACT结算技术不是用酒精固定剂,诸如乙醇和甲醇兼容。
该组织的水凝胶的聚合步骤也很关键生产高质量的组织下清算过程。因为氧抑制丙烯酰胺的聚合,它应该通过脱气在氮气气体注入系统的含有组织的溶液中除去。或者,脱氧化可以利用真空室23小时的热块来执行。
信息交换速率取决于许多因素,包括器官大小,脂质或ECM纤维蛋白的含量,定影条件等多数成年小鼠组织可以由ETC过夜清零。然而,存在的风险不必要过度清算和组织肿胀;由此,在结算时的差异是重要的考虑因素。组织清除条件应根据经验确定。重要的是,ECM的内容可能会影响清除组织的外观。组织的颜色仍然是白色或不透明的,甚至在ETC缓冲区中的ACT之后,因为法案没有明确密集的蛋白质纤维。然而,当这些器官浸渍于RI匹配溶液,该Ÿ变得透明。
组织肿胀率似乎是依赖于组织的细胞外基质的内容,和柔软的器官,如脑,表现出比稠密器官更大溶胀比。因为增加的组织肿胀将有助于组织清除程序,ACT常规利用蒸馏水水性缓冲在大多数情况下。在某些情况下,当组织肿胀或瞬态畸形是不可取的,如在胚,含缓冲液0.1×PBS可以应用于高分辨率成像。还应当指出的是在缓冲器中较高的盐浓度会导致组织的收缩。
act方法可以澄清一个鼠标14的整个器官,甚至全身。然而,透明组织的深层组织成像需要特殊的显微镜和目标。因此,脑组织1到2毫米厚的是最有效的用于与常规共焦显微镜成像。在我们的手中,去除标签从ACT处理的组织编着的抗体是抗体依赖的,因此不推荐使用不同的抗体标记的回合。一些抗体,如TH和GFAP,工作特别好为全脑免疫标记14。另一方面,一些抗体,如TUJ1或地图2,通常标组织的唯一的表面上。这可以通过其他方法,如开关15得到改善。另一个潜在的局限性在于它可能很难保持精蛋白结构中的ACT-加工的组织,因为在组织清除步骤的组织肿胀和收缩。
该PRESTO技术适用于多种组织标记技术。例如,在使用预标记的组织如SeeDB 4和iDISCO 7组织透明的方法,致密组织的免疫标记需要比数天至数周更长的潜伏期。然而,PRESTO可以缩短孵化时间为几个小时,Enabling用1毫米厚的致密组织的一天内的整个过程的完成。 PRESTO可以增强深标记厚,致密组织,或甚至未清除厚组织的功效。因为PRESTO使用台式离心机或注射器泵,并且不需要任何特殊的设备,这是比较容易实现与常规实验室程序这种技术。
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).
4% Paraformaldehyde | Lugen SCI | LGB-1175-4B | sample fixation |
Acrylamide | Affymetrix | 75820 | Hydrogel monomer solution |
2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries | VA-044 | Hydrogel monomer solution |
Boric acid | Affymetrix | 76324 | ETC buffer |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 18220 | ETC buffer |
Sodium hydroxide pellets | Junsei chemical | 1310-73-2 | ETC buffer |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323A | Immunolabeling |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Immunolabeling |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Immunolabeling |
Collagen type Ⅳ | Abcam | AB6586 | Antibody/immunolabeling |
Tyrosine hydroxylase (TH) | Millipore | AB152 | Antibody/immunolabeling |
Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | Secondary antibody/ immunolabeling |
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Life Technologies – Molecular Probes | A21206 | Secondary antibody/ immunolabeling |
Confocal dish | SPL lifesciences | 101350 | Imaging |
Confocal microscope | Leica | SP8 | Imaging |
Sucrose | Junsei chemical | 31365-0301 | CUBIC-mount solution |
Urea | Affymetrix | 23036 | CUBIC-mount solution |
N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine | Sigma-Aldrich | 122262 | CUBIC-mount solution |
ECT chamber | Logos Biosystems, Inc. | C10101 | ETC system |
ECT chamber controller | Logos Biosystems, Inc. | C10201 | ETC system |
Temperature probe | Logos Biosystems, Inc. | C12101 | ETC system |
Peristatic pump | Baoding longer precision pump Co., Ltd | YZ1515X | ETC system |
Buffer reservoir | Logos Biosystems, Inc. | C10401 | ETC system |
Tissue container | Logos Biosystems, Inc. | C12001 | ETC system |
Container holder for 1 tissue container | Logos Biosystems, Inc. | C12002 | ETC system |
Mouse brain slice holder | Logos Biosystems, Inc. | C12004 | ETC system |
Whole rat brain holder | Logos Biosystems, Inc. | C12007 | ETC system |
Peristaltic pump tubing | Logos Biosystems, Inc. | C12104 | ETC system |
Tabletop-centrifuge | Hanil science industrial Co., Ltd | MICRO 12 | c-PRESTO |
Syringe pump | Baoding longer precision pump Co., Ltd | LSP02-1B | s-PRESTO |
Syringe (20 ml) | Korea vaccine Co., Ltd. | KV-S20 | s-PRESTO |
3-way stopcock | Hyupsung medical Co.,Ltd. | HS-T-01N | s-PRESTO |