ACT-PRESTO (actieve duidelijkheid techniek drukgerelateerde efficiënte en stabiele overdracht van macromoleculen in organen) maakt een snelle, efficiënte, maar goedkope weefsel clearing en snelle antilichaam penetratie in de weefsels ontruimd door passieve diffusie of druk bijgestaan levering. Met behulp van deze methode, kan een breed scala van weefsels worden gewist, immunolabeled door meerdere antilichamen en volume-afgebeeld.
De identificatie en onderzoek van de gedetailleerde organisatie van organen of van het gehele lichaam op cellulair niveau belangrijke uitdagingen in de biologie. Overgangsmethoden vereisen een aanzienlijke hoeveelheid tijd en moeite om een 3D-beeld te verkrijgen en met het intacte weefsel snijden, immunokleuring en imaging serieel doorgesneden weefsel, dat een verlies van informatie levert bij elke stap van het proces. In recent ontwikkelde methoden voor hoge-resolutie beeldvorming binnen intact weefsel, is moleculaire karakterisering beperkt tot de etikettering van eiwitten. Echter momenteel beschikbare protocollen voor orgel clearing vereisen een aanzienlijk lange procestijd, waardoor het moeilijk uitvoerbaar weefsel clearing technieken in het laboratorium. We hebben onlangs een snelle en zeer reproduceerbare protocol genoemd ACT-PRESTO (a ctive c matigheid t echnique- p ressure r uitgelaten e fficient en s tafel t ransfervan macromoleculen in o rgans), die zorgt voor goedkeuring weefsel binnen enkele uren. Bovendien ACT-PRESTO maakt een snelle immunokleuring met conventionele methoden en versnelt antilichaam penetratie in de diepe laag van dicht gevormde, dikke exemplaren door het toepassen van druk of convectie flow. We beschrijven hoe weefsels, hoe om te wissen door lipide verwijderen met behulp van elektroforese voor te bereiden, en hoe immuno-vlekken door een druk bijgestaan levering. De snelheid en de consistentie van het protocol zullen de prestaties van 3D-histologisch onderzoek en op basis van volume diagnoses te bespoedigen.
Een van de uitdagingen in neurologie is de visualisatie van neuronale bedrading en individuele cellen in intacte hersenweefsel. Tot voor kort, het aantonen van de verbindingen tussen neuronen in deze manier vereist 1) seriële snijden van de weefsels; 2) de moleculaire kenmerken van specifieke doelen, zoals axonen of eiwitten; en 3) visualisatie van 3D-reconstructie van de hele hersenen via computationele registreren of aanpassing van de 2D-serie beelden 1. Deze stappen zijn omslachtig, vergen veel tijd, en zijn onderhevig aan informatie te verliezen tijdens het snijden en de etikettering, het maken van neurale netwerk in kaart brengen buitengewoon moeilijk. Maar veel methoden die het mogelijk maken de visualisatie van intact weefsel, zonder snijden ontwikkeld. Biologische weefsels kunnen optisch transparant worden gemaakt door het weefsel-clearing technieken 2-10. Een van de belangrijkste methoden is het brekingsindex verschil tussen de intacte weefsel en de onderdompeling oplossing om verminderenlichtverstrooiing te verminderen in het intacte weefsel, waardoor het weefsel rendering transparante en waardoor de waarneming van diepe structuren. Sommige soorten onderdompeling oplossingen hydrofobe eigenschappen, die resulteren in snelle quenching fluorescerende tijdens de dehydratatie procedure. Daarom deze methoden zijn niet compatibel met fluorescerende beeldvorming over een lange tijdsperiode 11,12. In plaats van hydrofobe reagentia andere manieren hydrofiele reagentia voor weefsel clearing, zoals SeeDB 4 en Sca l e 6, waarbij de structurele informatie en de fluorescentie van het biologisch weefsel 4,6,8 handhaven. Echter, macromoleculen, met inbegrip van antilichamen, kan niet de kern van het intacte weefsel alleen te bereiken door diffusie. Daarom is de pre-etikettering van doelmoleculen in diepe gebieden van opeengepakt weefsels is technisch uitdagend.
In een recent ontwikkelde weefsel-clearing methode, CLARITY 3, een hydrogel ingebed biologisch weefsel is gevormd met acrylamide en lipiden worden verwijderd door elektroforese onder natriumdodecylsulfaat (SDS) bevattende oplossing. Het monster wordt dan ondergedompeld in een oplossing met een bijpassende brekingsindex lichtverstrooiing 3 verminderen. Het lipide verwijdering systeem werd later gewijzigd in geavanceerde DUIDELIJKHEID 13 en PACT (passieve duidelijkheid techniek) 10. Na polymerisatie acrylamide kettingen verknopen van eiwitten, vormen hydrogel-weefsel. Lipidecomponenten kan verknopen met acrylamide; derhalve kunnen lipiden worden geëlimineerd door elektroforese onder SDS-bevattende buffer. Door de actieve verwijdering van lipiden, hersenweefsel sterk vergroot transparantie 9. Echter, deze werkwijzen niet de onmogelijkheid van diepe etiketteren door vrije diffusie. Om deze beperking te overwinnen, zijn technieken voor actief transport van reagentia in de diepste delen van dikke weefsels vereist.
Hoewel DUIDELIJKHEID maakt weefsel clearing en deep-tissuevisualisatie, het is geen makkelijke of snelle procedure. Het kan enkele weken duren om een hele hersenen van muizen 7,14 wissen. Rapid clearing van weefsels is essentieel voor de toepassing van dergelijke methoden om basis- of klinisch laboratorium instellingen voor biowetenschappelijk onderzoek of volume diagnose. Het huidige protocol voorziet in een vereenvoudigde procedure voor biologisch weefsel klaring en de daaropvolgende eiwit detectie door druk bijgestaan levering immuno-kleuring. Het is geschikt voor high-resolution volume beeldvorming van grote ingediend en 3D-systemen voor de verwerking door de combinatie met beeldvormende methoden.
Slechte fixatie of hydrogel onderdompeling in weefsels kunnen het verlies van eiwitten en de vervorming van weefsel tijdens het weefsel clearing proces veroorzaken. De totale volwassen muizenhersenen moet worden overnacht geïncubeerd in 4% paraformaldehyde, gevolgd door onderdompeling in een minimaal volume van 20 ml hydrogel monomeeroplossing voor 12-18 uur onder voorzichtig schudden. Voor grote weefsel zoals humaan weefsel zoals de hersenen en het ruggenmerg plakjes uitgebreid inweektijd in de hydrogel monomeeroplossing vereist. De ACT-protocol is gemakkelijk van toepassing op de clearing van de vaste weefsels, omdat het weefsel fixatie en polymeer infuus stappen worden gescheiden. Na weefsel clearing, werden menselijke weefsels goed gekleurd met verschillende antilichamen. Merk op dat de ACT zuiveringstechniek is niet compatibel met fixatieven alcohol, zoals ethanol en methanol.
Het weefsel-hydrogel polymerisatie stap is ook van cruciaal belang voor een goede kwaliteit weefsel te produceren na de clearing proces. Omdatzuurstof remt de polymerisatie van acrylamide, moet worden verwijderd door ontgassing het weefsel bevattende oplossing onder een stikstofgas infusiesysteem. Als alternatief kan de-zuurstof worden uitgevoerd met behulp van een vacuümkamer met een warmte-blok voor 23 uur.
De clearing tarief is afhankelijk van tal van factoren, waaronder het orgel grootte, de inhoud van lipiden of ECM vezelachtige eiwitten, de toestand van de fixatie, enz. De meeste volwassen muis weefsels kunnen 's nachts worden gewist door ETC. Er bestaat echter een gevaar van onnodige over- clearing en weefsel zwelling; dus de verschillen in clearing tijd zijn belangrijke overweging. Tissue-clearing voorwaarden moeten empirisch worden bepaald. Belangrijker is echter dat de inhoud van de ECM het uiterlijk van het weefsel vrijgemaakt beïnvloeden. De kleur van de weefsels blijft wit of ondoorzichtig, zelfs na de ACT in ETC buffer, omdat ACT niet dichte eiwitvezels te wissen. Wanneer deze organen werden ondergedompeld in RI passende oplossing, dey werd transparant.
De snelheid van delen zwelling wordt afhankelijk van de inhoud van de ECM weefsel en zachte organen, zoals de hersenen zijn vertonen een grotere zwelverhouding dan dichte organen. Omdat verhoogde weefsel zwelling zal helpen de tissue-clearing procedure, ACT routinematig maakt gebruik van gedestilleerd water gebaseerde buffer in de meeste gevallen. In sommige gevallen, wanneer delen zwelling of voorbijgaande vervorming is niet wenselijk, zoals in embryo's, buffer die 0,1 x PBS kunnen worden toegepast voor hoge-resolutie beeldvorming. Ook moet worden opgemerkt dat hogere zoutconcentraties in de buffer de krimp van weefsel kunnen veroorzaken.
De ACT werkwijze kan hele organen en zelfs het hele lichaam van een muis 14 verduidelijken. Echter, deep-tissue beeldvorming van transparante weefsel vereist speciale microscopen en doelstellingen. Aldus hersenweefsel 1 tot 2 mm dik is het meest effectief voor beeldvorming met een conventionele confocale microscoop. In onze handen, het verwijderen van het labeled antilichamen van ACT-verwerkte weefsels antilichaamafhankelijke en rondes van verschillende antilichaam labeling wordt afgeraden. Verschillende antilichamen, zoals TH en GFAP, werkte vooral goed voor de hersenen als geheel immunokleuring 14. Anderzijds, wat antilichamen, zoals Tuj1 of Map2, vaak aangeduid alleen het oppervlak van het weefsel. Dit kan worden verbeterd door andere werkwijzen, zoals SWITCH 15. Een andere potentiële beperking is dat het moeilijk kan zijn om fijne eiwitstructuren in-ACT verwerkte weefsel behouden vanwege de weefselzwelling en krimp tijdens het weefsel clearing stap.
De PRESTO techniek is toepasbaar op een grote verscheidenheid aan weefsel-labeltechnieken. Bijvoorbeeld, in weefsel-transparante methoden waarbij gelabelde weefsel, zoals SeeDB 4 en iDISCO 7, immunokleuring van dicht weefsel vereist incubatieperioden langer dan enkele dagen tot weken. Echter PRESTO kan de incubatietijd te verkorten tot enkele uren, enabling de voltooiing van het gehele proces binnen een dag 1 mm dik dicht weefsel. PRESTO kan de effectiviteit van deep-labeling dikke, dichte weefsel, of zelfs niet-ontruimde dikke weefsels te verbeteren. Omdat PRESTO gebruikt een tafelblad centrifuge of spuitpomp en geen speciale apparatuur nodig is het relatief gemakkelijk om deze techniek routine laboratorium procedures.
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).
4% Paraformaldehyde | Lugen SCI | LGB-1175-4B | sample fixation |
Acrylamide | Affymetrix | 75820 | Hydrogel monomer solution |
2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries | VA-044 | Hydrogel monomer solution |
Boric acid | Affymetrix | 76324 | ETC buffer |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 18220 | ETC buffer |
Sodium hydroxide pellets | Junsei chemical | 1310-73-2 | ETC buffer |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323A | Immunolabeling |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Immunolabeling |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Immunolabeling |
Collagen type Ⅳ | Abcam | AB6586 | Antibody/immunolabeling |
Tyrosine hydroxylase (TH) | Millipore | AB152 | Antibody/immunolabeling |
Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | Secondary antibody/ immunolabeling |
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Life Technologies – Molecular Probes | A21206 | Secondary antibody/ immunolabeling |
Confocal dish | SPL lifesciences | 101350 | Imaging |
Confocal microscope | Leica | SP8 | Imaging |
Sucrose | Junsei chemical | 31365-0301 | CUBIC-mount solution |
Urea | Affymetrix | 23036 | CUBIC-mount solution |
N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine | Sigma-Aldrich | 122262 | CUBIC-mount solution |
ECT chamber | Logos Biosystems, Inc. | C10101 | ETC system |
ECT chamber controller | Logos Biosystems, Inc. | C10201 | ETC system |
Temperature probe | Logos Biosystems, Inc. | C12101 | ETC system |
Peristatic pump | Baoding longer precision pump Co., Ltd | YZ1515X | ETC system |
Buffer reservoir | Logos Biosystems, Inc. | C10401 | ETC system |
Tissue container | Logos Biosystems, Inc. | C12001 | ETC system |
Container holder for 1 tissue container | Logos Biosystems, Inc. | C12002 | ETC system |
Mouse brain slice holder | Logos Biosystems, Inc. | C12004 | ETC system |
Whole rat brain holder | Logos Biosystems, Inc. | C12007 | ETC system |
Peristaltic pump tubing | Logos Biosystems, Inc. | C12104 | ETC system |
Tabletop-centrifuge | Hanil science industrial Co., Ltd | MICRO 12 | c-PRESTO |
Syringe pump | Baoding longer precision pump Co., Ltd | LSP02-1B | s-PRESTO |
Syringe (20 ml) | Korea vaccine Co., Ltd. | KV-S20 | s-PRESTO |
3-way stopcock | Hyupsung medical Co.,Ltd. | HS-T-01N | s-PRESTO |