Summary

Kurtarma Zamanı Artan ve Sınırlı Enflamatuar Yanıtları içinde Vagus sinir stimülasyonu Mekanizmaları Eğitim için LPS İdaresi Azalmış

Published: March 29, 2017
doi:

Summary

Vagus nerve stimulation has proven to have a strong efficacy for decreasing peripheral inflammation. Here, we present a modified vagus nerve stimulation protocol that allows for further examinations of the cholinergic anti-inflammatory mechanisms in limited inflammatory responses.

Abstract

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release cytokines and other mediators of inflammation. For a long time, humoral and cellular mechanisms have been studied for their role in regulating the immune response, but recent advances in the field of immunology and neuroscience have also unraveled specific neural mechanisms with interesting therapeutic potential. The so-called cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP) has been described to control innate immune responses and inflammation in a very potent manner. In the early 2000s, Tracey and collaborators developed a technique that stimulates the vagus nerve and mimics the effect of the pathway. The methodology is based on the electrical stimulation of the vagus nerve at low voltage and frequency, in order to avoid any side effects of overstimulation, such as deregulation of heart rate variability. Electrical devices for stimulation are now available, making it easy to set up the methodology in the laboratory. The goal of this research was to investigate the potential involvement of prostaglandins in the CAP. Unfortunately, based on earlier attempts, we failed to use the original protocol, as the induced inflammatory response either was too high or was not suitable for enzymatic metabolism properties. The different settings of the original surgery protocol remained mostly unchanged, but the conditions regarding inflammatory induction and the time point before sacrifice were improved to fit our purposes (i.e., to investigate the involvement of the CAP in more limited inflammatory responses).

The modified version of the original protocol, presented here, includes a longer time range between vagus nerve stimulation and analysis, which is associated with a lower induction of inflammatory responses. Additionally, while decreasing the level of lipopolysaccharides (LPS) to inject, we also came across new observations regarding mechanistic properties in the spleen.

Introduction

Doğuştan bağışıklık organizmaların geniş bir alanda enfeksiyonlara ve hastalıklara karşı savunma derhal ilk satırı sağlar. Bu tehlike ortadan kaldırmak için primer bağışıklık tepkisi başlatır değil, ama aynı zamanda aktif hale patojen-spesifik bir şekilde ikincil bağışıklık karşılıklarını gerçekleştirir adaptif bağışıklık eğitiminde önemli bir rol oynar. Enflamasyon sırayla enfeksiyon alanına diğer bağışıklık hücrelerini çekme kabiliyetine sahip ve bu tür kızarıklık, şişlik, ağrı, fonksiyon kaybı ve ateş gibi inflamasyon kardinal belirtileri, ikna etmek sitokin ve kemokin bir bolluk, tarafından orkestra edildiği . süresi ve inflamasyon yoğunluğu çeşitli faktörlere bağlıdır, ancak iltihap çözme ve homeostazı geri kronik iltihaplı hastalıkların başlamasını önlemek için önemli bir adımdır. nörobilim ve immünoloji alanında son gelişmeler iltihaplanmayı kontrol etmek muazzam bir terapötik potansiyeli olan belirli sinirsel mekanizmaları açığa çıkarılmamışhem merkezi sinir sisteminde hem de çevresinde amasyon. Bu mekanizmalardan biri, otonom sinir sisteminin 4, 5 tarafından tahrik edilen enflamatuar refleks olarak bilinen kolinerjik, anti-enflamatuar yolu (CAP) olup.

Şu anda, inflamatuar mediatörler, merkezi sinir sistemine iltihabı durumuna ilişkin sinyaller duyu sinirleri aktive ve gönderme olduğu düşünülmektedir. Bir refleks yanıt sonra efferent vagus siniri tarafından etkinleştirilir. CAP anatomik detayları kapsamlı bir çalışma iki sinir oluşan bir parasempatik-sempatik modeli, vagus siniri ve dalak sinir sırasıyla 6 ortaya çıkarmıştır. CAP, aktive kolinerjik efferent vagus siniri henüz keşfedilecek bir mekanizma ile adrenerjik dalak sinir aktivasyonu ile sonuçlanan, çölyak-mezenterik ganglion sona erer. Bu şekilde aktive edilmiş dalak sinir, iç bilinmektedirbeyaz maddesinde bağışıklık hücreleri yakın, marjinal bölge ve CAP 7, 8, dalak, asil ve zorunlu organın kırmızı pulpunda vate. Dalak sinir uçlarından norepinefrin (NE) dalak T lenfositleri üzerinde eksprese gelen β 2 adrenerjik reseptörlere bağlanır. Bu da, bu şekilde sitokin üretimi ve iltihap 2 sınırlayıcı makrofajlar üzerinde α7 nikotinik asetilkolin reseptörleri (a7nACh), aktive kolin asetil transferazı (ChAT) aracılık ettiği asetilkolin (Ach) salınmasını tetikler. Sonuç olarak, sinir sistemi, periferik dokularda inflamasyonu düzenleyen ve yerel immün homeostasisi geri mümkün olduğu açıktır.

yolunun Adından da anlaşılacağı gibi, ACh sistemi bu nöro-immün düzenleyici yolunun işleyişi için merkezi öneme sahiptir. İlginç bir şekilde, mekanizma aktivasyonuna katılanCAP çevresi ve merkezi sinir sisteminde, farklı gibi görünmektedir. Dalakta nikotinik reseptörlerin önemi (α7nAChR) daha önce 9 gösterilmiştir edilmiş olsa da, muskarinik reseptörleri (mAChR) yolu 10, 11 merkez aktivasyonu için zorunludur. Öldürücü murin endotoksemi sırasında Daha yakın zamanda, merkezi olarak hareket eden M1 muskarinik agonist periferik olarak verilmesi önemli ölçüde bastırdı serumu ve dalak tümör nekroz faktörü α (TNFa), 12 sinyal sağlam vagus siniri ve dalak sinir gerekli bir eylem. Ayrıca, prostaglandin E 2 yoksun fareler (PGE2) Vagus sinir uyarımına yanıt mümkün değildi ve serum ve dalak 3 sitokin LPS ile uyarılan salımını aşağı regüle yoktu son göstermiştir. Bu nedenle, CAP aynı zamanda ana ACh pathw dışındaki sistemler tarafından düzenlenir olabiliray.

Vagus siniri, çünkü vücut dolanımı tabii gibi seçildi, karaciğer, akciğer, dalak, böbrek ve bağırsak 13 de dahil olmak üzere başlıca organların innerve. Bu büyük innervasyon ve vagus sinirinin çok kuvvetli immünosupresif etkisi göz önüne alındığında, CAP terapötik potansiyeli enflamatuar durumların geniş bir kapak olabilir. Uyuşturucu gövdeye eklenmiş Vagus siniri, elektriksel olarak (ya da mekanik olarak) geleneksel tedaviye voltaj ve frekans, aksine üzerinde kontrolü ile, aktive edilmiş olabilir. Denemeler kronik enflamasyonu 14 tedavisinde VNS klinik önemi test etmek için, örneğin, romatizma hastalarında halen devam etmektedir. Özet olarak, nöro-immün iletişim ve enflamasyon düzenleme geleneksel tedaviye olası bir alternatif tedavi sağlayacaktır araştırma, halen vardır. Bu nedenle, vagus sinirinin analizi stimülasyonn farklı innerve organlardaki etkisi ancak kronik enflamasyon hayvan modellerinde potansiyel terapötik etki de karakterizasyonu, kesinlikle verilerini kullanarak elde edilmesi ve yeni potansiyel tedavi edici hedefler için umut ediyorum.

Tracey ve meslektaşları 4 tarafından geliştirilen özgün metodoloji nedeniyle (LPS öldürücü dozda yoluyla) inflamatuvar yanıt aşırı uyarılması ve CAP aktivasyonu ve okuma-out arasında çok kısa bir zaman aralığına araştırma alanımızla aktarılmamıştır edilemedi. Mevcut yazıda, orijinal protokole yapılan değişiklikleri sunacak sitokin seviyeleri üzerinde iki farklı yöntemler karşılaştırın ve hedef organ (dalak) yeni ve karşı gözlem vurgulamaktadır.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri bakımı ve Karolinska Enstitüsünde, Stockholm yerel Etik Komitesi tarafından onaylanmış hayvanların kullanımı için kurallarına göre yapılmıştır. Yerel Etik Komitesi hayvan bakımı konusunda Avrupa Birliği direktiflerini takip eder. NOT: cerrahi (6 saat ile 1 saat karşı) ve LPS seviyesi (15 mg / kg karşı 2 mg / kg) enjekte sonra orijinal protokolden temel değişiklikler iyileşme süresi vardır. Aksi takdirde, ameliyattan kendisi…

Representative Results

TNFa ve interlökin-1 P (IL-1β) Düzeyi LPS Doz Cerrahisi sonra Zaman Atl Artan ve Azalan sonra Daha önce gösterildiği gibi, orijinal protokol kullanılarak, ki burada VNS TNFa seviyelerini ve IL-1 p (360.0 ± 40.21 ug / mg (39.7 ± 10.8 pg / VNS de mg, p <0.001 versus SHAM içinde 169.3 ± 24.9 ug / mg) azalır intraperitoneal LPS enjeksiyonundan (15 mg / kg) (Şekil 2A) sonra dalak VNS içinde 191.7 ± 2…

Discussion

2000'li yılların başında keşfinden beri OTP mekanizmaları iyice çalışılmıştır. Şimdi yolunun iyi bir resim var ve özellikle de hedef organ, dalak, çok verimli bir ekip olarak NE, hafıza T hücrelerinin, ACH ve makrofajlar çalışma inflamatuar mediatörler 2 aşağı düzenleyen nerede. Ayrıca, yakın zamanda tabii ki CAP 3 aktivasyonundan sonra dalak ACh salgılanması için zorunlu bir bileşenidir, özellikle fareler, işlevsel bir prostaglandin s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The study was supported by the Swedish Research Council, the Swedish Rheumatism Asociation, Karolinska Institute Foundations, Stockholm County Council, The Wallenberg Foundation, and the GV 80 Years’ Foundation for research. The authors would also like to thank Hannah Aucott for proofreading the manuscript.

Materials

Computer Toshiba Any computer is actually compatible
MP-150 data acquisition system Biopac Systems MP150WSW
Acknowledge software Biopac Systems
Mice C57Bl/6 Charles River
Anesthetic machine Simtec Engineering
Medical oxygen bottle AGA 107563
Medical air bottle  AGA 108639
Vetflurane (1000mg/g) Virbac 137317
LPS Sigma-Aldrich L2630
Saline Merck Millipore 1024060080
PBS 10X Sigma-Aldrich P5493 Diluted 10 times for used concentration
Syringe (1 ml) BD Plastipak 303172
Needles 23G KD-FINE 900284 0.6 x 30 mm (blue)
Microdissecting forceps (curved) Sigma-Aldrich F4142
Dissecting scissors Sigma-Aldrich Z265969
Surgical suture 4-0 Ethicon G667G
Euthanasia unit Euthanex Smartbox EA-32000
Cavilon No Sting Barrier Film 3M Health Care 3346N
TH1/TH2 9-Plex assay, ultrasensitive kit MesoScale Discovery K15013C-1

References

  1. Nathan, C. Points of control in inflammation. Nature. 420 (6917), 846-852 (2002).
  2. Rosas Ballina, M., et al. Acetylcholine-synthesizing T cells relay neural signals in a vagus nerve circuit. Science. 334 (6052), 98-101 (2011).
  3. Le Maître, E., et al. Impaired vagus-mediated immunosuppression in microsomal prostaglandin E synthase-1 deficient mice. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 121 (Part B), 155-162 (2015).
  4. Borovikova, L. V., et al. Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin. Nature. 405 (6785), 458-462 (2000).
  5. Olofsson, P. S., Rosas-Ballina, M., Levine, Y. A., Tracey, K. J. Rethinking inflammation: neural circuits in the regulation of immunity. Immunol. Rev. 248 (1), 188-204 (2012).
  6. Pavlov, V. A., Tracey, K. J. Neural circuitry and immunity. Immunol Res. 63 (1-3), 38-57 (2015).
  7. Huston, J. M., et al. Splenectomy inactivates the cholinergic antiinflammatory pathway during lethal endotoxemia and polymicrobial sepsis. J. Exp. Med. 203 (7), 1623-1628 (2006).
  8. Rosas-Ballina, M., et al. Splenic nerve is required for cholinergic anti-inflammatory pathway control of TNF in endotoxemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 11008-11013 (2008).
  9. Wang, H., et al. Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation. Nature. 421 (6921), 384-388 (2003).
  10. Pavlov, V. A., et al. Central muscarinic cholinergic regulation of the systemic inflammatory response during endotoxemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (13), 5219-5223 (2006).
  11. Pavlov, V. A., et al. Brain acetylcholinesterase activity controls systemic cytokine levels through the cholinergic anti-inflammatory pathway. Brain Behav. Immun. 23 (1), 41-45 (2009).
  12. Rosas-Ballina, M., et al. Xanomeline suppresses excessive pro-inflammatory cytokine responses through neural signal-mediated pathways and improves survival in lethal inflammation. Brain Behav. Immun. 44, 19-27 (2014).
  13. Bellinger, D. L., Lorton, D., Lubahn, D., Felten, D. L., Ader, R., Felten, D. L., Cohen, N. . Psychoneuroimmunology. 55, 55-112 (2001).
  14. Andersson, U., Tracey, K. J. A new approach to rheumatoid arthritis: treating inflammation with computerized nerve stimulation. Cerebrum. 2012, 3 (2012).
  15. Ono, S. J., Nakamura, T., Miyazaki, D., Ohbayashi, M., Dawson, M., Toda, M. Chemokines: Roles in leucocyte development, trafficking, and effector function. J. Allergy Clin. Immunol. 111 (6), 1185-1199 (2003).
  16. Silvestre-Roig, C., Hidalgo, A., Soehnlein, O. Neutrophil heterogeneity: implications for homeostasis and pathogenesis. Blood. , (2016).
  17. Matteoli, G., Boeckxstaens, G. E. The vagal innervation of the gut and immune homeostasis. Gut. 62, 1214-1222 (2013).
  18. Pereira, M. R., Leite, P. E. The involvement of parasympathetic and sympathetic nerve in the inflammatory reflex. J. Cell. Physiol. 231, 1862-1869 (2016).
  19. Levine, Y. A., et al. Neurostimulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway ameliorates disease in rat collagen-induced arthritis. PLoS One. 9 (8), e104530 (2014).
  20. Huston, J. M., et al. Transcutaneous vagus nerve stimulation reduces serum high mobility group box 1 levels and improves survival in murine sepsis. Crit. Care Med. 35 (12), 2762-2768 (2007).
  21. Yuan, H., Silberstein, S. D. Vagus nerve and vagus nerve stimulation, a comprehensive review: Part II. Headache. 56 (2), 259-266 (2016).

Play Video

Cite This Article
Le Maître, E., Revathikumar, P., Estelius, J., Lampa, J. Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses. J. Vis. Exp. (121), e54890, doi:10.3791/54890 (2017).

View Video