Summary

Увеличение времени восстановления и снижение LPS администрации по изучению Нерв стимуляции блуждающего механизмов в ограниченной Воспалительные Ответы

Published: March 29, 2017
doi:

Summary

Vagus nerve stimulation has proven to have a strong efficacy for decreasing peripheral inflammation. Here, we present a modified vagus nerve stimulation protocol that allows for further examinations of the cholinergic anti-inflammatory mechanisms in limited inflammatory responses.

Abstract

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release cytokines and other mediators of inflammation. For a long time, humoral and cellular mechanisms have been studied for their role in regulating the immune response, but recent advances in the field of immunology and neuroscience have also unraveled specific neural mechanisms with interesting therapeutic potential. The so-called cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP) has been described to control innate immune responses and inflammation in a very potent manner. In the early 2000s, Tracey and collaborators developed a technique that stimulates the vagus nerve and mimics the effect of the pathway. The methodology is based on the electrical stimulation of the vagus nerve at low voltage and frequency, in order to avoid any side effects of overstimulation, such as deregulation of heart rate variability. Electrical devices for stimulation are now available, making it easy to set up the methodology in the laboratory. The goal of this research was to investigate the potential involvement of prostaglandins in the CAP. Unfortunately, based on earlier attempts, we failed to use the original protocol, as the induced inflammatory response either was too high or was not suitable for enzymatic metabolism properties. The different settings of the original surgery protocol remained mostly unchanged, but the conditions regarding inflammatory induction and the time point before sacrifice were improved to fit our purposes (i.e., to investigate the involvement of the CAP in more limited inflammatory responses).

The modified version of the original protocol, presented here, includes a longer time range between vagus nerve stimulation and analysis, which is associated with a lower induction of inflammatory responses. Additionally, while decreasing the level of lipopolysaccharides (LPS) to inject, we also came across new observations regarding mechanistic properties in the spleen.

Introduction

Врожденный иммунитет обеспечивает немедленную первую линию защиты против инфекций и заболеваний в широком диапазоне организмов. Она не только инициирует первичный иммунный ответ, чтобы устранить угрозу, но оно также играет ключевую роль в активации и обучение адаптивного иммунитета, который выполняет вторичные иммунные ответы в патоген-специфическим образом. Воспаление оркестровщик- множеством цитокинов и хемокинов, которые, в свою очередь, имеют возможность привлекать другие иммунные клетки к очагу инфекции и вызвать кардинальные признаки воспаления, такие как покраснение, отек, боль, потеря функции и лихорадка , Продолжительность и интенсивность воспаления зависят от нескольких факторов, но разрешение воспаления и восстановление гомеостаза является важным шагом, чтобы избежать возникновения хронических воспалительных заболеваний. Последние достижения в области неврологии и иммунологии разгадали конкретные механизмы нейронные с огромным терапевтическим потенциалом для контроля Влиянammation как в центральной нервной системе и на периферии. Одним из таких механизмов является холинергический противовоспалительный путь (САР), также известный как воспалительный рефлекс, который приводится в действие вегетативной нервной системы 4, 5.

В настоящее время считается, что воспалительные медиаторы активировать сенсорные нервы и посылают сигналы относительно состояния воспаления в центральной нервной системе. Рефлекс ответ затем активируется через эфферентный блуждающий нерв. Обширное исследование на анатомических деталях CAP выявило парасимпатическую-симпатическую модель , состоящую из двух нервов, блуждающий нерв и селезеночной нерв, соответственно 6. В CAP, активированный холинергический эфферентный блуждающий нерв заканчивается в глютеновом-брыжеечных ганглии, что приводит к активации адренергического селезеночного нерва с помощью механизма, еще предстоит исследовать. Селезеночный нерв, таким образом, активируется, как известен, внутренниеVate в непосредственной близости от иммунных клеток в белой пульпе, краевой зоне и красной пульпе селезенки, основные и обязательного орган CAP 7, 8. Норэпинефрина (NE) из селезеночных нервных окончаний связывается с соответствующими β 2 адренергических рецепторов , экспрессируемых на селезеночных Т – лимфоцитов. Это вызывает холина ацетил трансферазы (ХАТ) -опосредованного ацетилхолин (АХ) релиз, который , в свою очередь , активирует А7 никотиновые рецепторы ацетилхолина (α7nACh) на макрофагах, тем самым ограничивая продукцию цитокинов и воспаление 2. Следовательно, теперь ясно, что нервная система способна регулировать воспаление в периферических тканях и восстановления местного иммунного гомеостаза.

Как видно из названия пути предполагает, система АЧ имеет решающее значение для функционирования этого нейро-иммунных регулировочного пути. Интересно отметить, что механизмы, участвующие в активацииПСП, кажется, отличаются по периферии и в центральной нервной системе. В то время как значение никотиновых рецепторов (α7nAChR) в селезенке было показано ранее , 9, мускариновые рецепторы (mAChR) являются обязательными для центральной активации пути 10, 11. Совсем недавно, периферическое введение центрально-действующих М1 мускаринового агониста значительно подавленные сыворотки и опухоль селезенки фактор некроза α (TNF & alpha ; ) в течение летальной мышиной эндотоксемии, действие , которое требуется интактный блуждающий нерв и селезеночной нерв сигнализации 12. Мы также показали , что в последнее время мыши , лишенные простагландина Е 2 (PGE 2) не были способны реагировать на блуждающего нерва и не вниз регулировать LPS-индуцированное высвобождение цитокинов в сыворотке крови и селезенки 3. Таким образом, CAP также может регулироваться, кроме основного АХ pathw системау.

Блуждающий нерв был назван так потому , что его блуждающий конечно в организме, иннервирующих основные органы , включая печень, легкие, селезенку, почки и кишечник 13. Учитывая эту большую иннервацию и очень мощного иммунодепрессивное действие блуждающего нерва, терапевтический потенциал CAP может охватывать широкий спектр воспалительных состояний. Блуждающий нерв может быть электрический (или механически) активируется, с контролем над напряжением и частотой, и наоборот к обычному лечению, с никаких наркотиков не было добавлены к телу. Испытания в настоящее время проводятся в ревматических больных, например, чтобы проверить клиническую значимость ВНС при лечении хронического воспаления 14. В целом, нейро-иммунной связи и регуляция воспаления в настоящее время под следствием, что обеспечит возможную альтернативную обработку к обычной терапии. Поэтому анализ блуждающего нерва stimulatioп эффект в различных иннервируемых органах, но и характеристика потенциального терапевтического действия в животных моделей хронического воспаления, несомненно, даст понимание и надеется на новые потенциальных терапевтических целях.

Оригинальная методика , разработанная Tracey и его коллегами-не может быть перенесена на поле нашего исследования из – за перевозбуждения воспалительного ответа (летальной дозой LPS) и слишком короткий интервал времени между активацией CAP и считыванием. В данной работе, мы представим изменения, сделанные к первоначальному протоколу, сравнить две различные методологии на уровнях цитокин, а также выделить новое и противоположное наблюдение на целевом органе (селезенка).

Protocol

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами по уходу и использованию животных, утвержденных местного комитет по этике при Каролинском институте, Стокгольм. Комитет по этике местным следует директиве Европейского союза по уходу за животными. </…

Representative Results

Уровень ФНО и интерлейкина-1 (IL-1) после того, как увеличение промежутка времени после хирургии и снижения дозы LPS Как было показано ранее, используя оригинальный протокол, ВНС снизились уровни TNF & alpha; (169,3 ± 24,9 пг / мг в ложной операции пр?…

Discussion

С момента своего открытия в начале 2000-х годов, механизмы ПСП были тщательно изучены. Теперь у нас есть хорошее представление о пути, и в частности, орган – мишень, селезенку, где СВ, память Т – клетки, ACH и макрофаги работают как очень эффективная команда , чтобы подавлять воспалительные мед…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The study was supported by the Swedish Research Council, the Swedish Rheumatism Asociation, Karolinska Institute Foundations, Stockholm County Council, The Wallenberg Foundation, and the GV 80 Years’ Foundation for research. The authors would also like to thank Hannah Aucott for proofreading the manuscript.

Materials

Computer Toshiba Any computer is actually compatible
MP-150 data acquisition system Biopac Systems MP150WSW
Acknowledge software Biopac Systems
Mice C57Bl/6 Charles River
Anesthetic machine Simtec Engineering
Medical oxygen bottle AGA 107563
Medical air bottle  AGA 108639
Vetflurane (1000mg/g) Virbac 137317
LPS Sigma-Aldrich L2630
Saline Merck Millipore 1024060080
PBS 10X Sigma-Aldrich P5493 Diluted 10 times for used concentration
Syringe (1 ml) BD Plastipak 303172
Needles 23G KD-FINE 900284 0.6 x 30 mm (blue)
Microdissecting forceps (curved) Sigma-Aldrich F4142
Dissecting scissors Sigma-Aldrich Z265969
Surgical suture 4-0 Ethicon G667G
Euthanasia unit Euthanex Smartbox EA-32000
Cavilon No Sting Barrier Film 3M Health Care 3346N
TH1/TH2 9-Plex assay, ultrasensitive kit MesoScale Discovery K15013C-1

References

  1. Nathan, C. Points of control in inflammation. Nature. 420 (6917), 846-852 (2002).
  2. Rosas Ballina, M., et al. Acetylcholine-synthesizing T cells relay neural signals in a vagus nerve circuit. Science. 334 (6052), 98-101 (2011).
  3. Le Maître, E., et al. Impaired vagus-mediated immunosuppression in microsomal prostaglandin E synthase-1 deficient mice. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 121 (Part B), 155-162 (2015).
  4. Borovikova, L. V., et al. Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin. Nature. 405 (6785), 458-462 (2000).
  5. Olofsson, P. S., Rosas-Ballina, M., Levine, Y. A., Tracey, K. J. Rethinking inflammation: neural circuits in the regulation of immunity. Immunol. Rev. 248 (1), 188-204 (2012).
  6. Pavlov, V. A., Tracey, K. J. Neural circuitry and immunity. Immunol Res. 63 (1-3), 38-57 (2015).
  7. Huston, J. M., et al. Splenectomy inactivates the cholinergic antiinflammatory pathway during lethal endotoxemia and polymicrobial sepsis. J. Exp. Med. 203 (7), 1623-1628 (2006).
  8. Rosas-Ballina, M., et al. Splenic nerve is required for cholinergic anti-inflammatory pathway control of TNF in endotoxemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 11008-11013 (2008).
  9. Wang, H., et al. Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation. Nature. 421 (6921), 384-388 (2003).
  10. Pavlov, V. A., et al. Central muscarinic cholinergic regulation of the systemic inflammatory response during endotoxemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (13), 5219-5223 (2006).
  11. Pavlov, V. A., et al. Brain acetylcholinesterase activity controls systemic cytokine levels through the cholinergic anti-inflammatory pathway. Brain Behav. Immun. 23 (1), 41-45 (2009).
  12. Rosas-Ballina, M., et al. Xanomeline suppresses excessive pro-inflammatory cytokine responses through neural signal-mediated pathways and improves survival in lethal inflammation. Brain Behav. Immun. 44, 19-27 (2014).
  13. Bellinger, D. L., Lorton, D., Lubahn, D., Felten, D. L., Ader, R., Felten, D. L., Cohen, N. . Psychoneuroimmunology. 55, 55-112 (2001).
  14. Andersson, U., Tracey, K. J. A new approach to rheumatoid arthritis: treating inflammation with computerized nerve stimulation. Cerebrum. 2012, 3 (2012).
  15. Ono, S. J., Nakamura, T., Miyazaki, D., Ohbayashi, M., Dawson, M., Toda, M. Chemokines: Roles in leucocyte development, trafficking, and effector function. J. Allergy Clin. Immunol. 111 (6), 1185-1199 (2003).
  16. Silvestre-Roig, C., Hidalgo, A., Soehnlein, O. Neutrophil heterogeneity: implications for homeostasis and pathogenesis. Blood. , (2016).
  17. Matteoli, G., Boeckxstaens, G. E. The vagal innervation of the gut and immune homeostasis. Gut. 62, 1214-1222 (2013).
  18. Pereira, M. R., Leite, P. E. The involvement of parasympathetic and sympathetic nerve in the inflammatory reflex. J. Cell. Physiol. 231, 1862-1869 (2016).
  19. Levine, Y. A., et al. Neurostimulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway ameliorates disease in rat collagen-induced arthritis. PLoS One. 9 (8), e104530 (2014).
  20. Huston, J. M., et al. Transcutaneous vagus nerve stimulation reduces serum high mobility group box 1 levels and improves survival in murine sepsis. Crit. Care Med. 35 (12), 2762-2768 (2007).
  21. Yuan, H., Silberstein, S. D. Vagus nerve and vagus nerve stimulation, a comprehensive review: Part II. Headache. 56 (2), 259-266 (2016).

Play Video

Cite This Article
Le Maître, E., Revathikumar, P., Estelius, J., Lampa, J. Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses. J. Vis. Exp. (121), e54890, doi:10.3791/54890 (2017).

View Video