Summary

Aumento tempo di recupero e Diminuzione LPS Per studiare il nervo vago meccanismi di stimolazione in risposta infiammatoria limitati

Published: March 29, 2017
doi:

Summary

Vagus nerve stimulation has proven to have a strong efficacy for decreasing peripheral inflammation. Here, we present a modified vagus nerve stimulation protocol that allows for further examinations of the cholinergic anti-inflammatory mechanisms in limited inflammatory responses.

Abstract

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release cytokines and other mediators of inflammation. For a long time, humoral and cellular mechanisms have been studied for their role in regulating the immune response, but recent advances in the field of immunology and neuroscience have also unraveled specific neural mechanisms with interesting therapeutic potential. The so-called cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP) has been described to control innate immune responses and inflammation in a very potent manner. In the early 2000s, Tracey and collaborators developed a technique that stimulates the vagus nerve and mimics the effect of the pathway. The methodology is based on the electrical stimulation of the vagus nerve at low voltage and frequency, in order to avoid any side effects of overstimulation, such as deregulation of heart rate variability. Electrical devices for stimulation are now available, making it easy to set up the methodology in the laboratory. The goal of this research was to investigate the potential involvement of prostaglandins in the CAP. Unfortunately, based on earlier attempts, we failed to use the original protocol, as the induced inflammatory response either was too high or was not suitable for enzymatic metabolism properties. The different settings of the original surgery protocol remained mostly unchanged, but the conditions regarding inflammatory induction and the time point before sacrifice were improved to fit our purposes (i.e., to investigate the involvement of the CAP in more limited inflammatory responses).

The modified version of the original protocol, presented here, includes a longer time range between vagus nerve stimulation and analysis, which is associated with a lower induction of inflammatory responses. Additionally, while decreasing the level of lipopolysaccharides (LPS) to inject, we also came across new observations regarding mechanistic properties in the spleen.

Introduction

L'immunità innata fornisce immediatamente prima linea di difesa contro le infezioni e malattie in una vasta gamma di organismi. Essa non solo avvia la risposta immunitaria primaria per eliminare la minaccia, ma svolge anche un ruolo fondamentale nell'attivazione e educare l'immunità adattativa che svolge risposte immunitarie secondarie in modo specifico agente patogeno. L'infiammazione è orchestrato da una pletora di citochine e chemochine, che a loro volta hanno la capacità di attrarre altre cellule immunitarie al sito di infezione e di indurre i segni cardinali di infiammazione, come rossore, gonfiore, dolore, perdita di funzione, e la febbre . La durata e l'intensità dell'infiammazione dipendono da diversi fattori, ma risolvere l'infiammazione e ripristinando l'omeostasi è un passo fondamentale per evitare l'insorgenza di malattie infiammatorie croniche. I recenti progressi nel campo delle neuroscienze e immunologia hanno svelato i meccanismi neurali specifiche con immenso potenziale terapeutico per il controllo inflinfiammazione sia nel sistema nervoso centrale e nella periferia. Uno di essi consiste nello colinergica via anti-infiammatori (PAC), noto anche come il riflesso infiammatoria, che è azionato dal sistema nervoso autonomo 4, 5.

Attualmente è pensato che mediatori infiammatori attivano nervi sensoriali e inviare segnali relativi allo stato di infiammazione del sistema nervoso centrale. Una risposta riflessa viene quindi attivato attraverso il nervo vago efferente. Un ampio studio sui dettagli anatomici della PAC ha rivelato un modello parasimpatico-simpatico composto da due nervi, il nervo vago e nervo splenico, rispettivamente 6. Nella PAC, il nervo vago colinergica efferente attivato termina nel ganglio celiaco mesenterico, causando l'attivazione del nervo splenico adrenergico da un meccanismo ancora da esplorare. Il nervo splenico, così attivato, si caratterizza per internovate in prossimità di cellule immunitarie nella polpa bianca, zona marginale, e polpa rossa della milza, la principale e organo obbligatorio della PAC 7, 8. Norepinefrina (NE) dalle terminazioni nervose splenici lega ai corrispondenti β 2 adrenergici espressi sui linfociti T splenici. Questo induce il rilascio colina acetil transferasi (ChAT) acetilcolina mediata (ACh), che a sua volta attiva i recettori nicotinici dell'acetilcolina (a7) α7nACh sui macrofagi, limitando in tal modo la produzione di citochine e infiammazione 2. Di conseguenza, è chiaro che il sistema nervoso è in grado di regolare l'infiammazione nei tessuti periferici e di ripristinare omeostasi immunitaria locale.

Come il nome del percorso suggerisce, il sistema ACh è di importanza fondamentale per il funzionamento di questo percorso di regolazione neuro-immune. È interessante notare che i meccanismi coinvolti nell'attivazione diPAC sembrano essere differente nella periferia e nel sistema nervoso centrale. Mentre l'importanza dei recettori nicotinici (α7nAChR) nella milza è stata dimostrata in precedenza 9, recettori muscarinici (mAChR) sono obbligatorie per l'attivazione centrale del percorso 10, 11. Più recentemente, la somministrazione periferica di una azione centrale M1 agonista muscarinico notevolmente soppressa fattore di necrosi tumorale siero e milza α (TNFa) durante letale endotossemia murina, un'azione che richiedeva intatto nervo vago e nervo splenico segnalazione 12. Abbiamo inoltre recentemente dimostrato che topi privi prostaglandina E2 (PGE2) non erano in grado di rispondere alla stimolazione del nervo vago e non down-regolano il rilascio indotto da LPS di citochine nel siero e milza 3. Pertanto, la PAC potrebbe anche essere regolata da sistemi diversi dal principale pathw AChAy.

Il nervo vago è stata indicata come tale per la sua naturalmente vagare nel corpo, innervano organi principali compreso il fegato, polmone, milza, reni, intestino e 13. Considerando questo grande innervazione e molto potente effetto immunosoppressivo del nervo vago, il potenziale terapeutico della PAC potrebbe coprire un'ampia gamma di condizioni infiammatorie. Il nervo vago può essere elettricamente (o meccanicamente) attivato, con controllo della tensione e frequenza, e contrariamente al trattamento convenzionale, senza farmaci aggiunti al corpo. Le prove sono attualmente in corso in pazienti reumatici, per esempio, per testare il significato clinico di VNS nel trattamento di infiammazioni croniche 14. Complessivamente, la comunicazione e la regolazione di infiammazione neuro-immunitario sono attualmente allo studio, che fornirà un trattamento alternativo alla terapia convenzionale. Pertanto, l'analisi del nervo vago stimulatioEffetto n nei diversi organi innervati, ma anche la caratterizzazione del potenziale azione terapeutica in modelli animali di infiammazione cronica, sarebbe sicuramente dare spunti e di speranza per nuovi potenziali bersagli terapeutici.

La metodologia originale sviluppato da Tracey e colleghi 4 non poteva essere trasposto al nostro campo di ricerca a causa di eccesso di stimolazione della risposta infiammatoria (da una dose letale di LPS) e una troppo breve intervallo di tempo tra l'attivazione della PAC e il read-out. Nel presente documento, presenteremo le modifiche apportate al protocollo originale, confrontare i due metodi diversi su livelli di citochine, ed evidenziare un nuovo fronte osservazione sull'organo bersaglio (la milza).

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida per la cura e l'uso di animali approvati dal Comitato Etico locale Karolinska Institutet, Stoccolma. Il Comitato Etico locale segue le direttive dell'Unione europea in materia di cura degli animali. NOTA: I principali cambiamenti rispetto al protocollo originale sono il tempo di recupero dopo l'intervento chirurgico (6 ore contro 1 ora) e il livello di LPS iniettati (2 mg / kg contro …

Representative Results

Livello di TNFa e interleuchina-1β (IL-1β) dopo aver aumentato il Time Lapse dopo l'intervento e ridurre la dose di LPS Come mostrato in precedenza, utilizzando il protocollo originale, VNS diminuzione dei livelli di TNFa (169,3 ± 24,9 pg / mg in SHAM contro 39,7 ± 10,8 pg / mg in VNS, p <0.001) e IL-1β (360.0 ± 40.21 pg / mg SHAM contro 191,7 ± 27,2 pg / mg in VNS, p <0,01) nella milza dopo l'iniezione intra…

Discussion

Fin dalla sua scoperta nei primi anni 2000, i meccanismi della PAC sono stati accuratamente studiati. Ora abbiamo una buona immagine del percorso, e in particolare, l'organo bersaglio, la milza, dove NE, le cellule T memoria, Ach, e macrofagi lavorare come una squadra molto efficiente per down-regolare mediatori infiammatori 2. Abbiamo inoltre recentemente pubblicato dati sulla importanza di un sistema prostaglandine funzionale nei topi, in particolare, PGE 2, che è ovviamente un …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The study was supported by the Swedish Research Council, the Swedish Rheumatism Asociation, Karolinska Institute Foundations, Stockholm County Council, The Wallenberg Foundation, and the GV 80 Years’ Foundation for research. The authors would also like to thank Hannah Aucott for proofreading the manuscript.

Materials

Computer Toshiba Any computer is actually compatible
MP-150 data acquisition system Biopac Systems MP150WSW
Acknowledge software Biopac Systems
Mice C57Bl/6 Charles River
Anesthetic machine Simtec Engineering
Medical oxygen bottle AGA 107563
Medical air bottle  AGA 108639
Vetflurane (1000mg/g) Virbac 137317
LPS Sigma-Aldrich L2630
Saline Merck Millipore 1024060080
PBS 10X Sigma-Aldrich P5493 Diluted 10 times for used concentration
Syringe (1 ml) BD Plastipak 303172
Needles 23G KD-FINE 900284 0.6 x 30 mm (blue)
Microdissecting forceps (curved) Sigma-Aldrich F4142
Dissecting scissors Sigma-Aldrich Z265969
Surgical suture 4-0 Ethicon G667G
Euthanasia unit Euthanex Smartbox EA-32000
Cavilon No Sting Barrier Film 3M Health Care 3346N
TH1/TH2 9-Plex assay, ultrasensitive kit MesoScale Discovery K15013C-1

References

  1. Nathan, C. Points of control in inflammation. Nature. 420 (6917), 846-852 (2002).
  2. Rosas Ballina, M., et al. Acetylcholine-synthesizing T cells relay neural signals in a vagus nerve circuit. Science. 334 (6052), 98-101 (2011).
  3. Le Maître, E., et al. Impaired vagus-mediated immunosuppression in microsomal prostaglandin E synthase-1 deficient mice. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 121 (Part B), 155-162 (2015).
  4. Borovikova, L. V., et al. Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin. Nature. 405 (6785), 458-462 (2000).
  5. Olofsson, P. S., Rosas-Ballina, M., Levine, Y. A., Tracey, K. J. Rethinking inflammation: neural circuits in the regulation of immunity. Immunol. Rev. 248 (1), 188-204 (2012).
  6. Pavlov, V. A., Tracey, K. J. Neural circuitry and immunity. Immunol Res. 63 (1-3), 38-57 (2015).
  7. Huston, J. M., et al. Splenectomy inactivates the cholinergic antiinflammatory pathway during lethal endotoxemia and polymicrobial sepsis. J. Exp. Med. 203 (7), 1623-1628 (2006).
  8. Rosas-Ballina, M., et al. Splenic nerve is required for cholinergic anti-inflammatory pathway control of TNF in endotoxemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 11008-11013 (2008).
  9. Wang, H., et al. Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation. Nature. 421 (6921), 384-388 (2003).
  10. Pavlov, V. A., et al. Central muscarinic cholinergic regulation of the systemic inflammatory response during endotoxemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (13), 5219-5223 (2006).
  11. Pavlov, V. A., et al. Brain acetylcholinesterase activity controls systemic cytokine levels through the cholinergic anti-inflammatory pathway. Brain Behav. Immun. 23 (1), 41-45 (2009).
  12. Rosas-Ballina, M., et al. Xanomeline suppresses excessive pro-inflammatory cytokine responses through neural signal-mediated pathways and improves survival in lethal inflammation. Brain Behav. Immun. 44, 19-27 (2014).
  13. Bellinger, D. L., Lorton, D., Lubahn, D., Felten, D. L., Ader, R., Felten, D. L., Cohen, N. . Psychoneuroimmunology. 55, 55-112 (2001).
  14. Andersson, U., Tracey, K. J. A new approach to rheumatoid arthritis: treating inflammation with computerized nerve stimulation. Cerebrum. 2012, 3 (2012).
  15. Ono, S. J., Nakamura, T., Miyazaki, D., Ohbayashi, M., Dawson, M., Toda, M. Chemokines: Roles in leucocyte development, trafficking, and effector function. J. Allergy Clin. Immunol. 111 (6), 1185-1199 (2003).
  16. Silvestre-Roig, C., Hidalgo, A., Soehnlein, O. Neutrophil heterogeneity: implications for homeostasis and pathogenesis. Blood. , (2016).
  17. Matteoli, G., Boeckxstaens, G. E. The vagal innervation of the gut and immune homeostasis. Gut. 62, 1214-1222 (2013).
  18. Pereira, M. R., Leite, P. E. The involvement of parasympathetic and sympathetic nerve in the inflammatory reflex. J. Cell. Physiol. 231, 1862-1869 (2016).
  19. Levine, Y. A., et al. Neurostimulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway ameliorates disease in rat collagen-induced arthritis. PLoS One. 9 (8), e104530 (2014).
  20. Huston, J. M., et al. Transcutaneous vagus nerve stimulation reduces serum high mobility group box 1 levels and improves survival in murine sepsis. Crit. Care Med. 35 (12), 2762-2768 (2007).
  21. Yuan, H., Silberstein, S. D. Vagus nerve and vagus nerve stimulation, a comprehensive review: Part II. Headache. 56 (2), 259-266 (2016).

Play Video

Cite This Article
Le Maître, E., Revathikumar, P., Estelius, J., Lampa, J. Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses. J. Vis. Exp. (121), e54890, doi:10.3791/54890 (2017).

View Video