This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.
本稿では小さい全血サンプルから白血球の迅速かつ標準化された濃縮のためのプロトコルが記載されています。この手順は、赤血球の低張溶解に基づいており、人間のサンプルに、ならびに非ヒト由来の血液に適用することができます。約50〜100マイクロリットルの小さな初期サンプル量が実験小動物から再発採血にこの方法が適用可能になります。また、白血球の濃縮は、複数の実験室の環境では、この方法を適用すること、数分以内に、化学品及び計装に関する低い材料の努力によって達成されます。
白血球の標準化精製は、すなわち 、ヘムペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)および好酸球ペルオキシダーゼ(EPO)のハロゲン化ペルオキシダーゼ活性を評価するために高度に選択的な染色法と組み合わせた次亜塩素及び次亜臭素酸(HOClのとHOBr)の形成されています。 MPOが強くNEUTで発現されているがrophils、ヒト血液中だけでなく、単球における最も豊富な免疫細胞型は、関連する酵素EPOはもっぱら好酸球で発現されます。これらの酵素のハロゲン化活性をほとんどHOCl-及びHOBr特異的色素アミノフルオレセイン(APF)および一次ペルオキシダーゼ基質過酸化水素を使用することによって対処されます。その後のフローサイトメトリー分析にすべてのペルオキシダーゼ陽性細胞(好中球、単球、好酸球)を区別し、それらのハロゲン化ペルオキシダーゼ活性を定量化することができます。 APF染色は、細胞表面マーカーの適用と組み合わせることができるので、このプロトコルは、具体的には、白血球のサブ画分に対処するために拡張することができます。方法は、ヒトおよびげっ歯類の白血球の両方のHOClとHOBr産生を検出するために適用可能です。
慢性炎症性疾患におけるこれらの酵素の製品の普及と多様に議論免疫学的役割を考えると、このプロトコルは、より良い理解に貢献するかもしれません白血球由来のヘムペルオキシダーゼの免疫学的関連性。
多形核白血球(PMNを、とも呼ばれる顆粒球)および単球は、血液1,2における自然免疫系の重要な細胞成分を表します。彼らは、病原体に対する一次防御にだけでなく、獲得免疫系の活性化および全身性炎症反応2-4の開始に貢献しています。しかし、特に好中球、顆粒球の最も豊富な種類、および単球も大幅に急性炎症事象5の調節および終了に貢献しています。従って、これらの細胞はまた、リウマチ性関節炎6,7のような慢性炎症性疾患において重要な役割を果たし得ます。実際、喘息、慢性炎症性気道疾患において、好酸球のアポトーシス障害、血液8で2番目に顆粒型によって特徴付けられます。しかし、顆粒球のアポトーシスおよびマクロファージによるそれらの迅速な除去は、携帯終了時に2つの重要なステップであります炎症9-11の。
名前の免疫細胞密接に関連する2つの酵素、すなわち、ミエロペルオキシダーゼ(MPO、好中球および単球)と好酸球ペルオキシダーゼ(EPO、好酸球)で12,13を見つけることができます。彼らは二電子的殺菌特性14-16のために知られている対応するハイポ(擬似)halous酸に(擬似)ハロゲン化物を酸化ように、これらのヘムペルオキシダーゼは、古典的体液性免疫応答に関連しています。生理的条件下でMPO主にフォーム次亜塩素酸(HOClの)とhypothiocyanite( – OSCN)、後者と次亜臭素酸(HOBr)は、EPO 17-19によって形成されています。新しい結果は、この(擬似)ハロゲン化酵素活性はまた、炎症反応の調節にし、免疫反応20,21の終端に寄与し得ることを示唆しています。実際には、MPOおよび派生副産物のHOCl産生は、T細胞ベースの適応免疫応答22-2を抑制することが示されました4。
慢性炎症性疾患で、自然免疫系からの白血球の免疫学的役割に多くの洞察を得るためにこの生理機能にMPOおよびEPOの寄与を決定するために、我々はすぐに後続の特定のために少量の血液サンプルから白血球を豊かにする方法を開発しましたこれらの細胞におけるハロゲン化ペルオキシダーゼ活性の決意。赤血球の枯渇のために我々は低材料コストで迅速な白血球濃縮につながる蒸留水と2-その後の低張溶解工程を含む標準化された方法を選択しました。その後のハロゲン化MPOの決意とEPO活性についてHOCl-とHOBr特有の色素アミノフルオレセイン(APF)が25から27を使用しました。非特異的ペルオキシダーゼ染色法28,29のアプリケーションとは対照的に、このアプローチは、多くの場合、重度のINFLで損なわれるハロゲン化ペルオキシダーゼ活性の選択的検出を可能にしますammation 30,31。
好中球は、ヒト血液中で最も豊富な白血球であるとしてペルオキシダーゼ陽性細胞の単離は、多くの場合にのみ、これらの細胞に着目し、密度勾配遠心分離38によって他の白血球からの好中球の分離を含みます。好中球は、マウスの血液サンプルではるかに少ない豊富で、まだ後者より複雑な方法のための39の 40を使用しなければなりません。また、両方の方法はまた…
The authors have nothing to disclose.
This work was made possible by funding from the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, 1315883) as well as by the Sächsische Aufbaubank (SAB) project 100116526 from a funding of the European Regional Development Fund (ERDF).
materials/equipment | |||
15 ml centrifugation tubes | VWR/Corning | 734-0451 | – |
1.5 ml sample tubes | VWR/Eppendorf | 211-2130DE | – |
Pipettes for volumes up to 5 ml | Eppendorf | e.g. 3120000070 | We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100µl, 100-1000 µl an 500-5000µl |
laminar flow bench | Thermo Electron Corperation | HeraSafe | – |
Vortex mixer | Bender & Hobein AG | Vortex Genie 2 | – |
Tabletop centrifuge | Kendro Laboratory Products | Laborfuge 400R | The centrifuge should be able to be used at 450x g |
Small centrifuge | eppendorf | 5415D | The centrifuge should be able to be used at 400x g |
Incubator | Heraeus | cytoperm 2 | Settings: 37 °C, 95% humidity, 5 % CO2 content |
UV-Vis spectrophotometer | Varian | Cary 50 bio | A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied |
Flow cytometer | Becton, Dickinson | BD Facs Calibur | Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g 488 nm argon laser) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Phosphate buffered saline (PBS) | amresco | K812 | sterile solution, ready to use |
Sigma-Aldrich | P4417 | tablets for solving in 200 ml millipore water | |
Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca(2+) | Sigma-Aldrich | H1387 | 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4 |
Hydrochloric acid | Merck Millipore | 1.09057.1000 | 1M solution |
Sodium hydroxide | Riedel-deHaën | 30620 | Solid pellets. For a 1M solution solve 4 g/100 ml Millipore water |
Aminophenyl fluorescein | Cayman | 10157 | 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquotes of e.g. 100 µl should be prepared and stored at -20 °C |
Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements |
4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) | Sigma-Aldrich | A41909 | A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS |
DMSO | VWR chemicals | 23500.26 | – |