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Immunology and Infection

Schnelle und spezifische Bewertung der Halogenierungsagentien Peroxidaseaktivität in Leukozyten angereicherte Blutproben

Published: July 28, 2016
doi:
10.3791/54484
, , , , ,
1Institute for Medical Physics and Biophysics, Medical Faculty,University of Leipzig, 2Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology (IZI) Leipzig

Summary

This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

Abstract

In diesem Beitrag wird ein Protokoll für die schnelle und standardisierte Anreicherung von Leukozyten aus kleinen Vollblut-Proben beschrieben. Dieses Verfahren wird auf der hypotonischen Lyse der Erythrozyten basieren und kann als an Blut von nicht-menschlichen Ursprungs sowie für die menschliche Proben angewendet werden. Die geringe anfängliche Probenvolumen von etwa 50 bis 100 & mgr; l macht dieses Verfahren für wiederkehrende Blutentnahme von kleinen Labortieren. Darüber hinaus wird Leukozyten Anreicherung innerhalb von Minuten und mit geringem Material Anstrengungen in Bezug auf Chemikalien und Instrumentierung erreicht, ist dieses Verfahren anwendbar in mehreren Laborumgebungen.

Standardisierte Reinigung von Leukozyten wird mit einem hochselektiven Färbeverfahren kombiniert Halogenierung Peroxidaseaktivität von Häm – Peroxidasen, Myeloperoxidase (MPO) und eosinophile Peroxidase (EPO), dh die Bildung von unterchloriger und hypobromige Säure (HOCl und HOBr) auszuwerten. Während MPO stark in neut ausgedrücktrophils, die häufigste Immunzelltyp im menschlichen Blut sowie in Monozyten, die verwandten Enzym EPO wird ausschließlich in Eosinophilen exprimiert wird. Die Halogenierung Aktivität dieser Enzyme wird unter Verwendung der fast HOCl- und HOBr-spezifischen Farbstoff aminophenyl fluorescein (APF) und den primären Peroxidasesubstrat Wasserstoffperoxid behandelt. Bei der anschließenden Durchflusscytometrieanalyse alle Peroxidase-positive Zellen (Neutrophile, Monozyten, Eosinophilen) unterscheidbar und ihre Halogenierung Peroxidase-Aktivität quantifiziert werden können. Da APF Färbung kann mit der Anwendung von Zelloberflächenmarkern kombiniert werden, kann dieses Protokoll speziell verlängert werden, um Leukozyten-Unterfraktionen adressieren. Das Verfahren ist für HOCl und HOBr Produktion sowohl in der Human- und in Nagetier Leukozyten zu erkennen.

Angesichts der breiten und mannigfaltig diskutiert immunologische Rolle dieser enzymatischen Produkte in chronisch-entzündlichen Erkrankungen kann dieses Protokoll zu einem besseren Verständnis des beitragenimmunologischer Relevanz von Leucocyten abgeleitetes Häm Peroxidasen.

Introduction

Polymorphkernigen Leukozyten (PMNs, die auch als Granulozyten) und Monozyten sind wichtige zelluläre Komponenten des angeborenen Immunsystems im Blut 1,2. Sie tragen zur primäre Abwehr von Krankheitserregern sowie zur Aktivierung des erworbenen Immunsystems und die Einleitung einer systemischen Entzündungsreaktion 2-4. Doch vor allem Neutrophile, die am häufigsten vorkommende Art von Granulozyten und Monozyten tragen auch wesentlich zur Regulierung und die Beendigung der akuten entzündlichen Ereignisse 5. Daher können diese Zellen auch eine wichtige Rolle bei chronisch – entzündlichen Erkrankungen wie rheumatoider Arthritis 6,7 spielen. In der Tat, Asthma, eine chronische entzündliche Erkrankung der Atemwege, wird durch eine beeinträchtigte Apoptose von Eosinophilen gekennzeichnet, die zweithäufigste Granulozyten Typ im Blut 8. Doch die Apoptose von Granulozyten und deren schnelle Beseitigung durch Makrophagen sind zwei wesentliche Schritte, die während der zellulären BeendigungEntzündungs ​​11.09.

In den genannten Immunzellen zwei eng verwandte Enzyme, nämlich Myeloperoxidase (MPO, Neutrophilen und Monozyten) und eosinophile Peroxidase (EPO, Eosinophilen) können 12,13 gefunden werden. Diese Häm Peroxidasen klassisch sind mit der humoralen Immunantwort , wie sie im Zusammenhang mit zwei elektronisch zu oxidieren (pseudo-) -halogenide zu dem entsprechenden hypo (pseudo) halogenhaltige Säuren , die für ihre bakterizide Eigenschaften 14-16 bekannt sind. Unter physiologischen Bedingungen MPO hauptsächlich Formen Hypochlorsäure (HOCl) und hypothiocyanite (- OSCN) , während die letztere und Hypobromsäure (HOBr) durch EPO 17-19 gebildet werden. Neue Ergebnisse deuten darauf hin , dass diese (pseudo-) Halogenierung Enzymaktivität auch für die Regulierung der Entzündungsreaktionen und zur Beendigung von Immunreaktionen 20,21 beitragen. In der Tat wurden die HOCl Produktion von MPO und daraus abgeleitete Produkte gezeigt T – Zell-basierte adaptive Immunantwort 22-2 zu unterdrücken4.

Um weitere Einblicke in die immunologischen Rolle der Leukozyten aus dem angeborenen Immunsystems bei chronischen Entzündungskrankheiten zu gewinnen und den Beitrag von MPO und EPO dieser physiologischen Funktion zu bestimmen, haben wir ein Verfahren, um schnell Leukozyten aus kleinen Blutproben für einen nachfolgenden spezifischen reichern Bestimmung der Halogenierung Peroxidase-Aktivität in diesen Zellen. Für Erythrozyten-Depletion haben wir ein standardisiertes Verfahren mit zwei nachfolgenden hypotone Lyse Schritte mit destilliertem Wasser ausgewählt, die bei niedrigen Materialkosten zu einer schnellen Leukozyten-Anreicherung führt. Für die anschließende Bestimmung der Halogenierung MPO und Aktivität EPO die HOCl- und HOBr-spezifischen Farbstoff aminophenyl Fluorescein (APF) wurde 25-27 verwendet. Im Gegensatz zu der Anwendung von unspezifischen Peroxidase Färbemethoden 28,29, ermöglicht dieser Ansatz die selektive Erfassung der Halogenierung Peroxidase – Aktivität, die häufig bei schweren infl beeinträchtigt wirdammation 30,31.

Protocol

Alle menschlichen Blutproben wurden von gesunden Freiwilligen erhalten und die angelegte Leukozyten-Anreicherung Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig. Die Versuche mit Rattenblut wurden von der zuständigen örtlichen Ethikkommission (Landesdirektion Sachsen, Referat 24), nach den deutschen Richtlinien für die Tierpflege und Verwendung zugelassen. 1. Experimenteller Aufbau Hinweis: Da die hypotone…

Representative Results

Wie zuvor berichtet , oben gedreht beschriebene Verfahren geführt anwendbar sowohl für die menschliche zu sein und nicht menschlichen Material 32. Außerdem, wie für die Mäuse, die mit asthmatischen Symptomen der Färbung APF gezeigt ist, kann ein geeignetes Werkzeug sein, um Unterschiede in der systemische proinflammatorische Zustand erkennen. Deshalb wird in einer anschließenden Studie , die wir dieses Protokoll zur Bewertung wiederholt die Halogenierung Aktivität von …

Discussion

Als Neutrophile die häufigsten Leukozyten im menschlichen Blut die Isolierung von Peroxidase-positive Zellen sind oft konzentriert sich nur auf diesen Zellen und enthält eine Trennung von Neutrophilen von anderen Leukozyten durch Dichtegradientenzentrifugation 38. Doch wie Neutrophile viel weniger reichlich in murine Blutproben sind 39 für die letztere komplizierteren Methoden müssen 40 verwendet werden. Darüber hinaus auch beide Methoden zur Entfernung von Peroxidase-positive führ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was made possible by funding from the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, 1315883) as well as by the Sächsische Aufbaubank (SAB) project 100116526 from a funding of the European Regional Development Fund (ERDF).

Materials

materials/equipment
15 ml centrifugation tubes VWR/Corning 734-0451 –
1.5 ml sample tubes VWR/Eppendorf 211-2130DE –
Pipettes for volumes up to 5 ml Eppendorf e.g. 3120000070 We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100µl, 100-1000 µl an 500-5000µl
laminar flow bench Thermo Electron Corperation HeraSafe –
Vortex mixer Bender & Hobein AG Vortex Genie 2 –
Tabletop centrifuge Kendro Laboratory Products Laborfuge 400R The centrifuge should be able to be used at 450x g
Small centrifuge eppendorf 5415D The centrifuge should be able to be used at 400x g
Incubator Heraeus cytoperm 2 Settings: 37 °C, 95% humidity, 5 % CO2 content
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary 50 bio A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied
Flow cytometer Becton, Dickinson BD Facs Calibur Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g 488 nm argon laser)
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Phosphate buffered saline (PBS) amresco K812 sterile solution, ready to use
Sigma-Aldrich P4417 tablets for solving in 200 ml millipore water
Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca(2+) Sigma-Aldrich H1387 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4
Hydrochloric acid Merck Millipore 1.09057.1000 1M solution
Sodium hydroxide Riedel-deHaën 30620 Solid pellets. For a 1M solution solve 4 g/100 ml Millipore water
Aminophenyl fluorescein Cayman 10157 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquotes of e.g. 100 µl should be prepared and stored at -20 °C
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich H1009 This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements
4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) Sigma-Aldrich A41909 A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS
DMSO VWR chemicals 23500.26 –
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Flemmig, J., Schwarz, P., Bäcker, I., Leichsenring, A., Lange, F., Arnhold, J. Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples. J. Vis. Exp. (113), e54484, doi:10.3791/54484 (2016).
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