Caracterización de las células dendríticas derivadas de monocitos humanos mediante imágenes de Citometría de Flujo: una comparación entre dos protocolos de aislamiento de monocitos
Summary
This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.
Abstract
Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 – 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded > 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.
Introduction
Las células dendríticas (DC) son mediadores esenciales de los sistemas inmune innata y adaptativa. Funcionan para inducir respuestas inmunes primarias y facilitar el desarrollo de la memoria inmunológica. Estas células son los principales responsables de captura de antígeno, la migración y la estimulación de las células T y por lo tanto se conocen como células presentadoras de antígenos (APC) profesionales 1 .Manipulation de países en desarrollo podría ser utilizado en una amplia variedad de campos de investigación y en la práctica clínica para el tratamiento de diferentes enfermedades inflamatorias tales como el VIH 6,7, cáncer, enfermedades autoinmunes 8 9, y las respuestas alérgicas 10. DCs también se están utilizando para la investigación de abuso de sustancias con el fin de resolver los mecanismos desconocidos y vías, tales como los asociados con la dependencia del alcohol 11 a 14, la dependencia de drogas 13,15, y la combinación de la infección y la sustancia VIH abuso 16-19. Estos estudios en curso y futuros estudios de investigación in el campo de la inmunología hacer en la generación in vitro de los países en desarrollo muy importante para la investigación. Sin embargo, hay varias dificultades asociadas con el aislamiento de las DC a partir de sangre humana, ya que sólo constituyen 0,1 a 1% de las células mononucleares de sangre total 20.
Hasta la fecha, algunos de los métodos bien establecidos para la generación de DCs in vitro consiste en plástico o vidrio adherencia de monocitos 21,22, densidad de centrifugación en gradiente de 23, la separación basada marcador específico tal como de células activadas por clasificación magnética 22, de células activadas por fluorescencia de clasificación 24, la selección positiva de los monocitos CD14 + utilizando nanopartículas magnéticas recubiertas de dextrano 25, y el rápido aislamiento de los monocitos altamente purificados usando selección celular negativa totalmente automatizado 26. Sin embargo, el mejor método de elección sigue siendo controvertido. Por lo tanto, para mejorar las técnicas de generación de corriente continua, varios métodos han sido desarrollados en la quela pureza de estas células se puede aumentar en gran medida por la diferenciación de las células y los monocitos purificados progenitoras CD34 + aisladas a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) 27. Como se ha mencionado antes, un método ampliamente utilizado y popular para la generación de células dendríticas derivadas de monocitos (MDDCs) es explorar la capacidad de los monocitos se adhieran al vidrio o plástico (método de adherencia) 21,22,27. El método de adherencia es un método rápido y sencillo que no requiere el uso de equipos complejos. Sin embargo, algunas desventajas de este proceso incluyen la contaminación de linfocitos, baja flexibilidad, y monocitos manipulación transitoria 28. Un método alternativo al método de adhesión es el aislamiento magnético de los monocitos de PBMC totales, en particular con el uso de un kit de monocitos enriquecimiento humano, que está diseñado para aislar los monocitos de PBMC por selección negativa 26. Durante este procedimiento, las células no deseadas son objeto de extracción con tetraméricacomplejos de anticuerpos y partículas magnéticas recubiertas de dextrano. La ventaja de este método de aislamiento es que las células marcadas no deseadas se separan mediante un imán, mientras que las células diana se pueden verter libremente fuera en un nuevo tubo sin necesidad de columnas. Hasta la fecha, con la disponibilidad de anticuerpos monoclonales específicos que pueden etiquetar las poblaciones de células únicas, la técnica de separación magnética se ha convertido en no simplemente un método adicional, sino una necesidad para el aislamiento de células raras en el campo de la inmunología. Por ejemplo, las técnicas tales como clasificación celular magnética con paramagnéticas disponibles comercialmente MACS-nanopartículas han facilitado el desarrollo de nuevos enfoques para la investigación y aplicaciones clínicas 22,29. Por otra parte, los estudios de investigación recientes que comparan la generación de DC a partir de métodos de adherencia de monocitos y la tecnología MACS han demostrado una mayor pureza y la viabilidad de CC utilizando MACS monocitos 22,30 separadas.
Los presentes estudios actualesuna comparación entre dos métodos para la generación de DCs humanas de monocitos aislados de PBMC: 1) los monocitos de aislamiento por adherencia y 2) el aislamiento de monocitos por selección negativa utilizando un kit comercial de monocitos enriquecimiento humano. Este estudio proporciona evidencia para demostrar que la selección procedimiento de separación magnética negativa para aislar monocitos genera el mayor rendimiento de monocitos con diferencias significativas en la viabilidad de monocitos en comparación con los monocitos aislados por el método de adherencia. A su vez, después de siete días, los monocitos aislados por separación magnética diferencian en MDDCs con significativamente mayor capacidad de proliferación y una mayor cantidad de células que expresan doble positivo (+ CD11c / CD14 +) fenotipo sin afectar MDDC viabilidad. En general, el estudio actual se diferencia de los estudios anteriores mencionadas anteriormente, ya que demuestra la capacidad de ambas técnicas para generar simultáneamente monocitos que son capaces de proliferar y diferenciarse en CD11c +MDDCs (> 70%) después de siete días en cultivo sin comprometer su viabilidad. Además, el enfoque actual prevé la primera caracterización de tiempo / poblaciones diferentes CD11c CD14 MDDCs por el flujo de imágenes citometría.
En resumen, ya que los países en desarrollo desempeñan un papel central en relación con la investigación en el campo de la inmunología, diferentes parámetros deben tenerse en cuenta a la hora de considerar cómo se han obtenido y qué métodos se utilizan para aislar y cultivar en vitro. Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo proporcionar información sobre dos diferentes métodos de aislamiento de monocitos y cómo estos métodos afectan diferencialmente la viabilidad de monocitos y el rendimiento con el tiempo afecta a la viabilidad de células dendríticas, proliferación y fenotipo. Estos hallazgos contribuirán en gran medida al campo de la inmunología y proporcionarán un protocolo detallado de DC aislamiento, purificación y caracterización.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sobre la base de las dificultades conocidas de aislar y generar MDDCs a partir de sangre humana, el presente estudio tuvo como objetivo proporcionar una comparación exhaustiva de los dos métodos bien establecidos para la generación de MDDCs. El primer método en comparación es un método tradicional bien establecida para la generación de MDDCs mediante la explotación de la capacidad de los monocitos para adherirse al vidrio o de plástico (método de adherencia) 21,22,27. El método de adherencia es rá…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research is supported by the National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, award K99/R00 AA021264. Additional lab support as part of startup package has been received from the Department of Immunology, Institute of NeuroImmune Pharmacology, Herbert Wertheim College of Medicine, and FIU- Office of Research and Economic Development. Gianna Casteleiro was supported by NIH/NIGMS R25 GM061347. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | Must be used at room temperature |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010-023 | |
| ACK Lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| RoboSep buffer | StemCell | 20104 | |
| EasySep Human monocyte enrichment kit | StemCell | 19059 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0101 | |
| FITC-Dextran | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Synergy 2 multi-mode reader | Biotek | 7131000 | |
| XTT Sodium salt bioreagent (XTT) | Sigma Aldrich | X4626-100MG | |
| Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) | Sigma Aldrich | D8418-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) | Sigma Aldrich | m5655-500MG | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad | 161-0302 | |
| Phenazine Methosulfate (DMSO) | Sigma Aldrich | P9626-1G | |
| Inactivated (HI) Human Serum | Chemicon | S1-100ML | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Accuri | 653119 | |
| FlowSight Amnis Flow Cytometer | EMD Millipore | 100300 |
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