توصيف الخلايا الجذعية البشرية الوحيدات المستمدة من التصوير التدفق الخلوي: مقارنة بين اثنين من بروتوكولات الوحيدات عزل
Summary
This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.
Abstract
Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 – 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded > 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.
Introduction
الخلايا الجذعية (DCS) هي سطاء الأساسية للأنظمة المناعة الفطرية والتكيفية. أنها تعمل على إحداث الاستجابة المناعية الأولية وتسهيل تطوير الذاكرة المناعية. هذه الخلايا هي المسؤولة في المقام الأول عن القبض على مستضد والهجرة وتحفيز الخلايا التائية، وبالتالي يشار إلى مستضد الخلايا كما المهنية (ناقلات الجنود المدرعة) 1 .Manipulation من البلدان النامية يمكن استخدامها عبر مجموعة واسعة من المجالات البحثية وفي إعداد سريرية لعلاج مختلفة الأمراض الالتهابية مثل فيروس نقص المناعة البشرية 6،7، سرطان 8، 9 أمراض المناعة الذاتية، والاستجابات التحسسية 10. كما تستخدم البلدان النامية للبحث تعاطي المخدرات من أجل حل آليات ومسارات مجهولة مثل تلك المرتبطة إدمان الكحول 11-14، إدمان المخدرات 13،15، والجمع بين العدوى وتعاطي المخدرات فيروس نقص المناعة البشرية 16-19. هذه الدراسات الجارية والدراسات البحثية المستقبلية طن مجال علم المناعة تجعل في الجيل المختبر من البلدان النامية في غاية الأهمية للبحث. ومع ذلك، هناك العديد من الصعوبات المرتبطة عزل البلدان النامية من الدم البشري لأنها تشكل فقط 0،1-1٪ من مجموع خلايا الدم وحيدات النوى 20.
حتى الآن، بعض الطرق الراسخة لتوليد البلدان النامية في المختبر يتكون من البلاستيك أو الزجاج التزام حيدات 21،22، والكثافة الطرد المركزي التدرج 23، محددا الفصل على علامة مثل خلية تنشيط المغناطيسية فرز 22، فلوري خلية تنشيط الفرز 24، واختيار إيجابية من وحيدات CD14 + باستخدام المغلفة ديكستران النانوية المغناطيسية 25، والعزلة السريع لحيدات العالية النقاء باستخدام مؤتمتة بالكامل السلبية تحديد الخلية 26. ومع ذلك، فإن أفضل طريقة لاختيار ما زال مثيرا للجدل. لذلك، لتحسين تقنيات الجيل العاصمة، وقد وضعت العديد من الطرق التينقاء هذه الخلايا يمكن أن يزيد بشكل كبير من التمايز من CD34 + السلف الخلايا وحيدات تنقية معزولة من خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMCs) 27. كما ذكر قبل، وهي طريقة تستخدم على نطاق واسع وشعبية لتوليد الوحيدات المستمدة الخلايا الجذعية (MDDCs) هو استكشاف قدرة حيدات التمسك الزجاج أو البلاستيك (طريقة الالتزام) 21،22،27. طريقة الالتزام هو طريقة سريعة ومباشرة التي لا تتطلب استخدام معدات معقدة. ومع ذلك، بعض مساوئ هذه العملية تشمل تلوث اللمفاويات، مرونة منخفضة، والوحيدات التلاعب عابر 28. طريقة بديلة لطريقة الالتزام هو العزلة المغناطيسية للحيدات من إجمالي PBMCs، خصوصا مع استخدام عدة تخصيب الوحيدات الإنسان، الذي يهدف إلى عزل حيدات من PBMCs عن طريق الانتقاء السلبية 26. خلال هذا الإجراء، يتم استهداف الخلايا غير المرغوبة لإزالة مع رباعي القسيماتمجمعات الأجسام المضادة والجسيمات المغناطيسية المغلفة ديكستران. وميزة هذه الطريقة العزلة هي أن الخلايا المسمى غير المرغوب فيها يتم فصل باستخدام مغناطيس في حين أن الخلايا المستهدفة يمكن سكب بحرية قبالة في أنبوب جديد دون الحاجة للأعمدة. حتى الآن، مع توافر الاجسام المضادة المحددة التي يمكن تسمية السكان الخلية فريدة من نوعها، أصبحت تقنية الفصل المغناطيسي ليس مجرد وسيلة إضافية، بل ضرورة لعزل خلايا نادرة في مجال علم المناعة. على سبيل المثال، تقنيات مثل خلية الفرز المغناطيسي مع المتاحة تجاريا ممغطس أجهزة ماكينتوش-النانوية سهلت تطوير مناهج جديدة للبحوث والتطبيقات السريرية 22،29. وعلاوة على ذلك، وقد أثبتت الدراسات والأبحاث الحديثة مقارنة الجيل العاصمة من أساليب الالتزام الوحيدات والتكنولوجيا بالاعمال نقاء العاصمة العالي وقابلية استخدام أجهزة ماكينتوش فصل حيدات 22،30.
ويعرض الدراسة الحاليةمقارنة بين طريقتين لتوليد البلدان النامية الإنسان من وحيدات معزولة عن PBMCs: 1) عزل الوحيدات من الالتزام و2) عزل الوحيدات عن طريق الانتقاء السلبية باستخدام طقم تخصيب الوحيدات الإنسان التجارية. وتقدم هذه الدراسة أدلة تثبت أن اختيار الإجراء والفصل المغناطيسي السلبي لعزل حيدات يولد أعلى عائد من وحيدات مع عدم وجود اختلافات كبيرة في جدوى الوحيدات بالمقارنة مع حيدات معزولة بسبب طريقة الالتزام. في المقابل، وبعد سبعة أيام، وحيدات معزولة بواسطة مغناطيس متباينة في MDDCs مع قدرة التكاثري أعلى بكثير وأعلى كمية من الخلايا معربا عن إيجابية مزدوج (CD11c و+ / CD14 +) النمط الظاهري دون التأثير على قابلية MDDC. وعموما، تختلف الدراسة الحالية من الدراسات السابقة المشار إليها أعلاه لأنه يدل على قدرة كل من تقنيات لتوليد في وقت واحد وحيدات القادرة على التكاثر والتفريق في CD11c و+MDDCs (> 70٪) بعد سبعة أيام في الثقافة دون المساس حيويتها. وبالإضافة إلى ذلك، يوفر النهج الحالي لتوصيف أول مرة من CD11c ومختلف / السكان CD14 MDDCs عن طريق التدفق الخلوي التصوير.
وخلاصة القول، منذ البلدان النامية تلعب دور أساسي فيما يتعلق البحوث في مجال علم المناعة، يجب أن تؤخذ العوامل المختلفة في الاعتبار عند النظر في كيفية تشتق منها وما هي الأساليب المستخدمة لعزل والثقافة لهم في المختبر. ولذلك، تهدف هذه الدراسة إلى تقديم رؤى على طريقتين مختلفتين من العزلة الوحيدات وكيف أن هذه الأساليب تؤثر بشكل مختلف الجدوى الوحيدات والعائد تؤثر في نهاية المطاف شجيري بقاء الخلية، والانتشار، والنمط الظاهري. وسوف تسهم هذه النتائج إلى حد كبير في مجال علم المناعة، وسوف توفر بروتوكول مفصلة من العاصمة العزلة، وتنقية، والتوصيف.
Protocol
Representative Results
Discussion
وبناء على الصعوبات المعروفة للعزل وتوليد MDDCs من دم الإنسان، هذه الدراسة تهدف إلى تقديم مقارنة شاملة طريقتين راسخة لتوليد MDDCs. الطريقة الأولى مقارنة هو الطريقة التقليدية الراسخة لتوليد MDDCs من خلال استغلال قدرة حيدات التمسك الزجاج أو البلاستيك (طريقة الالتزام) 21،22،2…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research is supported by the National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, award K99/R00 AA021264. Additional lab support as part of startup package has been received from the Department of Immunology, Institute of NeuroImmune Pharmacology, Herbert Wertheim College of Medicine, and FIU- Office of Research and Economic Development. Gianna Casteleiro was supported by NIH/NIGMS R25 GM061347. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | Must be used at room temperature |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010-023 | |
| ACK Lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| RoboSep buffer | StemCell | 20104 | |
| EasySep Human monocyte enrichment kit | StemCell | 19059 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0101 | |
| FITC-Dextran | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Synergy 2 multi-mode reader | Biotek | 7131000 | |
| XTT Sodium salt bioreagent (XTT) | Sigma Aldrich | X4626-100MG | |
| Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) | Sigma Aldrich | D8418-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) | Sigma Aldrich | m5655-500MG | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad | 161-0302 | |
| Phenazine Methosulfate (DMSO) | Sigma Aldrich | P9626-1G | |
| Inactivated (HI) Human Serum | Chemicon | S1-100ML | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Accuri | 653119 | |
| FlowSight Amnis Flow Cytometer | EMD Millipore | 100300 |
References
- Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
- Banchereau, J., et al. Immunobiology of Dendritic Cells. Ann Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Kaouther, M., Ridha, O. Dendritic Cell-Based Graft Tolerance. ISRN Pharmacol. , (2011).
- Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. J Exp Med. 157, 613-627 (1983).
- Nair, M. N., et al. RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy. AAPS J. 7, E572-E578 (2005).
- Agudelo, M., et al. Chapter 10. Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions. , 167-177 (2010).
- Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines – past progress and future strategies. Immunotherapy. , (2015).
- Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells. Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).
- Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy. Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).
- Zwolak, A., et al. Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders. Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).
- Agudelo, M., et al. Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users. Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).
- Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials. J Alcohol Drug Depend. 3, 184 (2015).
- Boukli, N. M., et al. Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).
- Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells. J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).
- Napuri, J., et al. Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155. PLoS ONE. 8, e83682 (2013).
- Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells. Life Sciences. 88, 987-994 (2011).
- Nair, M. P. N., et al. Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients. J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).
- Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC). Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).
- Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood. J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).
- Davis, G. The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion. Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).
- Delirezh, N., Shojaeefar, E. Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells. Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).
- Lehner, M., Holter, W. Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus<sup>®</sup>. Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).
- Van Brussel, I., et al. Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques. J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).
- Mucci, I., et al. The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells. Biologicals. 37, 288-296 (2009).
- Yuan, N., et al. . The American Association of Immunologists (AAI). , (2007).
- Romani, N., et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med. 180, 83-93 (1994).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
- El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial. Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).
- Curry, C. V. . Differential Blood Count. , (2015).
- Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).
- Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation. Blood. 92, 1598-1607 (1998).
- Ardeshna, S. M., et al. Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction. Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).
- Chapuis, F., et al. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).
- Zhou, L. J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).
- Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).
- Caux, C., et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).
- Fujii, S. i., Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation. J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).
- Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding. Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).
