Summary

イメージングフローサイトメトリーによるヒト単球由来樹状細胞の特徴付け:二つの単球の分離プロトコルの比較

Published: October 18, 2016
doi:

Summary

This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

Abstract

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 – 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded > 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.

Introduction

樹状細胞(DC)は、先天性および適応免疫系の重要なメディエーターです。それらは、一次免疫応答を誘導し、免疫記憶の発達を促進するように機能します。これらの細胞は、抗原捕捉、移動およびT細胞刺激の主な原因であり、したがって、DCの.Manipulation異なる治療するための研究分野の広範囲にわたって、臨床設定で利用できる1とプロフェッショナル抗原提示細胞(APC)と呼ばれますそのようなHIV 6,7、8などの炎症性疾患、自己免疫疾患9、およびアレルギー応答10。 DCはまた、アルコール依存11-14、薬物依存13,15、及びHIV感染および物質乱用16-19の組み合わせに関連するものなどの未知のメカニズムおよび経路を解決するために、薬物乱用の研究に使用されています。これらの継続的な研究と今後の調査研究Inは免疫学の分野は、研究のために非常に重要なDCの試験管内世代行います。総血単核細胞20の1% -しかし、彼らは0.1を構成するように、ヒトの血液からのDCの単離に関連するいくつかの困難があります。

現在までに、樹状細胞のインビトロ生成のための十分に確立された方法のいくつかは、22の選別、磁気活性化細胞、蛍光活性化セルソーティングとして単球21,22のプラスチックまたはガラス付着、密度勾配遠心分離23、特定のマーカーに基づく分離で構成され24、デキストラン被覆磁性ナノ粒子25、および完全に自動化された負の細胞選択26を使用して高度に精製された単球の迅速な単離を使用して、CD14 +単球の陽性選択。しかし、選択の最良の方法は、議論の余地が。したがって、DCの生成技術を改善するために、いくつかの方法は、開発されていますこれらの細胞の純度が大きく、末梢血単核細胞(PBMC)27から単離され精製されたCD34 +前駆細胞と単球から分化により増加させることができます。前に述べたように、単球由来樹状細胞(MDDCs)を生成するために広く使用され、人気の方法は、ガラスやプラスチック(接着法)21,22,27に接着する単球の能力を探ることです。付着方法は、複雑な装置の使用を必要としない迅速かつ簡単な方法です。しかし、この方法のいくつかの欠点は、リンパ球汚染、低柔軟性、および単球過渡操作28を含みます。付着方法に代わる方法としては、特にネガティブ選択26によってPBMCから単球を単離するために設計されたヒト単球濃縮キットを使用して、総PBMCから単球の磁気分離です。この手順の間、不要な細胞には、四量体による除去の対象とされています抗体複合体とデキストラン被覆磁性粒子。この分離方法の利点は、不要な標識された細胞は、標的細胞が自由に列を必要とすることなく、新たなチューブに注ぎ出しすることができるが、磁石を用いて分離されることです。現在までに、ユニークな細胞集団にラベルを付けることができ、特定のモノクローナル抗体の利用可能性と、磁気分離技術は、単に追加の方法が、免疫学の分野では珍しい細胞の単離の必要はないとなっています。例えば、市販の常磁性MACS-ナノ粒子とソーティングなど磁気細胞などの技術は、研究と臨床応用22,29のための新たなアプローチの開発を促進しました。さらに、単球の接着およびMACS技術方法からDCの生成を比較した最近の調査研究は、単球22,30分離MACSを使用して、より高いDC純度および生存率を示しました。

現在の研究のプレゼント市販のヒト単球濃縮キットを使用してネガティブ選択により付着および2)単球の単離によって1)単球の単離:PBMCから単離した単球からのヒトDCの生成のための2つの方法の間の比較。この研究は、接着方法によって単離された単球と比較した場合、単球を単離するためのネガティブ選択磁気分離手順は、単球の生存率に有意な差を有する単球の最も高い収量を生成することを示す証拠を提供します。ターンでは、7日後、磁気分離によって単離された単球は、MDDCの生存率に影響を与えることなく、有意に高い増殖能と二重陽性(のCD11c + / CD14 +)の表現型を発現する細胞の高い量とMDDCsに分化しました。それは同時に、増殖およびCD11cに分化することができる単球を生成するために、両方の技術の能力を実証するため、全体的に、現在の研究では、+上で参照した以前の研究とは異なり彼らの生存能力を損なうことなく、培養中7日後MDDCs(> 70%)。また、現在のアプローチは、フローサイトメトリーを撮像して異なるのCD11c / CD14 MDDCs集団の初回の特徴付けを提供します。

DCは免疫学の分野の研究について焦点役割を果たしているので、それらが誘導されている方法を検討し、どのような方法は、 インビトロでそれらを分離し、培養するために使用されている場合要約すると、異なるパラメータを考慮しなければなりません。そこで、本研究では、二つの異なる単球の単離の方法とどのようにこれらの方法は差動で、最終的に、樹状細胞の生存率、増殖、および表現型に影響を与える単球の生存率および収量に影響を与えるの洞察を提供することを目的とします。これらの知見は、免疫学の分野に大きく貢献するとDCの単離、精製、およびキャラクタリゼーションの詳細なプロトコルを提供します。

Protocol

全体的にヒト血液の研究をレビューし、IRBプロトコル承認#のIRB-13から0440 FIUの治験審査委員会(IRB)によって承認されています。ヒトロイコパックは、マイアミ、フロリダ州のコミュニティ血液バンクから購入しました。 標準的な密度勾配法によるPBMCの1の単離 T75フラスコ中の1×リン酸緩衝生理食塩水で血液の1希釈:1を実行します。 ピペット注意深く15…

Representative Results

磁気分離により単球の収量は遵守法による単球の収量に比べて高いです PBMCおよび単球の分離の分離の日にトリパンブルー排除法により図1の表示PBMCおよび単球細胞数で示されたデータ。磁気分離により単離された単球がPBMCの最大25%を占めながら、平均して、接着方法によって単離された?…

Discussion

単離したヒト血液からMDDCsを生成する既知の難しさに基づいて、本研究はMDDCsを生成するための2つのよく確立された方法の総合的な比較を提供することを目的としました。比較第一の方法は、ガラスやプラスチック(接着法)21,22,27に接着する単球の能力を活用することによってMDDCsを生成するための十分に確立された伝統的な方法です。付着方法は、迅速かつ費用効果的であり、複?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research is supported by the National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, award K99/R00 AA021264. Additional lab support as part of startup package has been received from the Department of Immunology, Institute of NeuroImmune Pharmacology, Herbert Wertheim College of Medicine, and FIU- Office of Research and Economic Development. Gianna Casteleiro was supported by NIH/NIGMS R25 GM061347. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

Materials

Ficoll-Paque GE Healthcare 17-5442-03 Must be used at room temperature
Phosphate-buffered saline (PBS) Life Technologies 10010-023
ACK Lysing buffer Quality Biological 118-156-101
RPMI 1640 medium Life Technologies 22400-089
Antibiotic-Antimycotic (100X) Life Technologies 15240-062
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16000-044
RoboSep buffer StemCell 20104
EasySep Human monocyte enrichment kit StemCell 19059
TC20 Automated cell counter Bio-Rad 145-0101
FITC-Dextran Sigma Aldrich FD4-100MG
Trypan blue stain (0.4%) Life Technologies 15250-061
Synergy 2 multi-mode reader Biotek 7131000
XTT Sodium salt bioreagent (XTT) Sigma Aldrich X4626-100MG
Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) Sigma Aldrich D8418-500ML
Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) Sigma Aldrich m5655-500MG
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0302
Phenazine Methosulfate (DMSO) Sigma Aldrich P9626-1G
Inactivated (HI) Human Serum Chemicon S1-100ML
Accuri C6 Flow Cytometer BD Accuri 653119
FlowSight Amnis Flow Cytometer EMD Millipore 100300

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Figueroa, G., Parira, T., Laverde, A., Casteleiro, G., El-Mabhouh, A., Nair, M., Agudelo, M. Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols. J. Vis. Exp. (116), e54296, doi:10.3791/54296 (2016).

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