Combinada Near-infrared imagens fluorescentes e tomografia Micro-computado para Diretamente Visualizando Cerebral tromboêmbolos
Summary
Este protocolo descreve a aplicação de tomografia combinada fluorescente no infravermelho próximo (NIRF) e imagiologia de micro-computadorizada (microCT) para visualizar tromboêmbolos cerebral. Esta técnica permite a quantificação da carga de trombo e evolução. A técnica de imagem NIRF visualiza fluorescente etiquetado trombo no cérebro extirpado, enquanto que a técnica microCT visualiza trombo no interior de animais vivos usando ouro-nanopartículas.
Abstract
imaging trombo direta visualiza a causa raiz de infarto tromboembólica. Ser capaz de trombo imagem permite diretamente muito melhor investigação de acidente vascular cerebral do que depender de medições indiretas, e será uma ferramenta de pesquisa vascular potente e robusto. Nós usamos uma abordagem de imagem óptico que rotula trombos com um marcador trombo imagiologia molecular – um Cy5.5 fluorescente no infravermelho próximo (NIRF) sonda que está ligado de forma covalente às cadeias de fibrina do trombo pela acção enzimática-reticulação de fibrina de activado factor de coagulação XIII, durante o processo de maturação coágulo. Uma abordagem baseada tomografia computadorizada-micro (microCT) utiliza nanopartículas de ouro de procura de trombo (AuNPs) funcionalizados para atingir o principal componente do coágulo: fibrina. Este documento descreve um protocolo detalhado para o combinado in vivo microCT e ex vivo NIRF imagem de tromboembolismo em um rato modelo de acidente vascular cerebral embólico. Mostra-se que in vivo </ em> microCT e AuNPs glicol-quitosana-alvejado fibrina (FIB-GC-AuNPs) pode ser usado para visualizar tanto em trombos situ e trombos embolia cerebral. Nós também descrevem a utilização de imagiologia de trombos in vivo directa baseada microCT para monitorizar os efeitos terapêuticos em série de plasminogénio de tecido mediada por activador de trombólise. Após a última sessão de imagens, demonstramos por ex vivo NIRF imagem da extensão e a distribuição de tromboembolismo residual no cérebro. Finalmente, descrevemos imagem análises quantitativas de dados de imagem microCT e NIRF. A técnica de imagiologia de trombos combinado directa permite dois métodos independentes de visualização de trombo a ser comparados: a área de sinal fluorescente relacionadas com o trombo em ex vivo NIRF de imagem em relação ao volume de trombos hiperdenso microCT in vivo.
Introduction
Uma em cada 6 pessoas vão ter um acidente vascular cerebral em algum momento de sua vida. acidente vascular cerebral isquêmico é de longe o tipo de acidente vascular cerebral mais comum, e é responsável por cerca de 80 por cento de todos os casos de AVC. Porque tromboêmbolos fazer com que a maioria destes acidentes vasculares cerebrais isquêmicos, existe um interesse crescente em imagem direta do trombo.
Estima-se que cerca de 2 milhões de células cerebrais morrem durante cada minuto de oclusão da artéria cerebral média 1, levando ao slogan "Tempo é cérebro". A tomografia computadorizada (TC) estudos pode ser feito rapidamente, e estão amplamente disponíveis; por esta razão, CT continua a ser a imagem de escolha para o diagnóstico e tratamento de acidente vascular cerebral isquêmico hyperacute inicial. CT é particularmente valioso para informar as decisões iniciais críticos: a administração de ativador do plasminogênio tecidual (tPA) para trombólise e / ou triagem para endovascular coágulo de recuperação de 2. De corrente baseado CT imagiologia de trombos, no entanto, não é possível controlar em série cerebral tromboêmbolos in vivo, porque ele usa métodos indiretos para demonstrar trombos: após opacificação da poça de sangue por contraste iodado, os trombos são demonstrados como preenchimento de defeitos nos vasos. Há limites de dose e riscos associados com a administração repetida de contraste iodado, que impedem repetidas imagens de trombos desta maneira.
Assim, há uma necessidade crítica para uma metodologia de imagem directa para trombo cerebral em pacientes com AVC, para permitir melhores decisões de tratamento mais rápido e a ser feita. Propomos para alcançar este através do aumento do valor de TC, a modalidade de imagem de primeira linha actualmente utilizado para acidente vascular cerebral, com a utilização de um agente de imagiologia molecular nanoparticular de procura de trombo.
Demonstrámos a utilização deste agente por meio de tomografia computadorizada de micro (microCT), um de alta resolução ex vivo ou in vivo (animal pequeno) versão imagiologia de CT que permite a aquisição de dados rápida <sup> 3,4. Mesmo com a relativamente pobre contraste tecido mole disponível para pequena microCT animais (muito pior do que disponível a partir de scanners de tamanho humano), o agente de imagem foi capaz de procurar e marcar trombos, tornando-os hiperdensa na CT, um "sinal navio densa" reforçada pela molecular imagiologia.
Complementando a técnica de CT, o nosso grupo previamente desenvolveu uma técnica de imagem trombo óptico directo usando sonda Cy5.5 fluorescente no infravermelho próximo (NIRF) para visualizar fardo trombo cerebral 5. Esta é uma técnica ex vivo em post mortem cérebros, mas é altamente sensível, e serve para confirmar dados in vivo no ambiente de pesquisa.
Tendo CT e NIRF base técnicas de imagem em busca de trombo nos permite comparar e contrastar estas técnicas para obtenção de dados altamente informativos sobre o papel do trombo e imagem trombo no processo de desenvolvimento de acidente vascular cerebral isquêmico.
Here, nós descrevemos um protocolo detalhado de uma técnica combinada de microCT in vivo e ex vivo NIRF imagiologia para visualizar diretamente tromboêmbolos num modelo de rato de acidente vascular cerebral embólico. Estes métodos simples e robustas são úteis para fazer avançar nossa compreensão de doenças trombóticas, permitindo que o precisas na avaliação in vivo de trombo carga / distribuição e caracterização da evolução trombo dinâmica de uma forma rápida e quantitativa in vivo durante a terapia, seguido de dados ex vivo que serve como um controle e padrão de referência para a confirmação da in vivo achados de imagem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós demonstramos o uso de duas técnicas de imagem molecular complementares para a imagem latente trombo direta em modelos experimentais de acidente vascular cerebral embólico: a fibrina alvo de nanopartículas de ouro (FIB-GC-AUNP) para imagens com base em microCT in vivo, e uma FXIIIa alvo sonda de imagem óptico para ex vivo de imagens fluorescentes.
Após a administração intravenosa de FIB-GC-AuNPs, trombos tornou-se visível a CT como estruturas densas, causado pel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Coréia Healthcare Tecnologia R & D Project, Ministério da Saúde e Bem-Estar (HI12C1847, HI12C0066), o Programa Bio & Medical Technology Development (2010-0019862) e do programa de Global Research Lab (GRL) (NRF-2015K1A1A2028228) do Fundação nacional de Pesquisa, financiado pelo governo coreano.
Materials
| Machines | |||
| microCT | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | |
| NIRF imaging system | Roper-scientific,Tucson, AZ | coolsnap-Ez | |
| Laser Doppler flowmeter | Perimed, Stockholm, Sweden | PeriFlux System 5000 | |
| Surgical microscope | Leica Microsystems, Seoul, Korea | EZ4HD | |
| Inhalation anesthesia machine | PerkinElmer, Massachusetts, USA | XGI-8 | |
| Software | |||
| NFR control | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | microCT control software |
| Lucion | Infinitt, Seoul, Korea | Lucion | 3D render imaging software |
| Lab chart 7 | ADInstruments, Colorado, USA | Lab chart 7 | rCBF |
| Image J software | Wanye Rasband, NIH, USA | 1.49d | imaging analysis |
| Devices/Instruments | |||
| Infusion pump | Harvard, Massachusetts, USA | pump 22(55-2226) | |
| Homeothermic blanket | Panlab, Barcelona, Spain | HB101 | |
| Pocket cautery | Daejong, Seoul, Korea | DJE-39 | |
| Brain matrice | Ted pella, CA, USA | 15003 | coronal section |
| PE-50 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-45(PE-50) | I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm |
| PE-10 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-10(PE-10) | I.D. 0.28mm O.D. 0.61 mm |
| 30 gauge needle | sungshim-medical, Seoul, Korea | ||
| Syringe | CPL-medical, Ansan, Korea | 1 & 3 cc | |
| Gauze | Panamedic, Cheonan, Korea | ||
| Tape | Scotch, Seoul, Korea | 3M-810 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 11253-27 | Dumont #L5 |
| Micro scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 15000-03 | Vannas spring |
| Scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 14084-08 | 8.5 cm |
| Black silk suture | Ailee, Busan, Korea | SK6071, SK728 | 6-0 and 7-0 |
| Reagents | |||
| meloxicam | Yuhan, Seoul, Korea | ||
| vet ointment | Novartis, Basel, Swiss | ||
| 10% Povidone-iodine (betadine) | Firson, Cheon-an, Korea | ||
| FeCl3 | Sigma, Missouri, United States | 157740-5G | |
| TTC | Amresco, Ohio, USA | 0765-100g | |
| Isoflurane | Hana-Pham, Gyeonggi, Korea | Ifran | 100 mL |
| PBS | Welgene, Daegu, Korea | LB001-02 | 500 mL |
| Gold nanoparticles | Synthesis | ||
| C15 optical agent | Synthesis | ||
| Tissue plasminogen activator | Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany | rtPA(actilyse) | 20 mg |
| Normal saline | Daihan Pham, Seoul, Korea | 48N3AF3 | 20 mL |
References
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