Combiné proche infrarouge imagerie fluorescente et la tomographie par Micro-calculé pour Directement Visualizing cérébrale thromboembolies
Summary
Ce protocole décrit l'application de la tomographie combinée fluorescent proche infrarouge (NIRF) imagerie et micro-ordinateur (microCT) pour la visualisation de thromboembolie cérébrale. Cette technique permet la quantification de la charge de thrombus et d'évolution. La technique d'imagerie marqué par fluorescence NIRF visualise un thrombus dans le cerveau excisé, alors que la technique de thrombus à l'intérieur de la microCT visualise les animaux vivants en utilisant des nanoparticules d'or.
Abstract
imagerie de thrombus direct visualise la cause de l'infarctus thromboembolique. Être en mesure de l'image thrombus permet directement beaucoup mieux enquête d'accident vasculaire cérébral que de compter sur des mesures indirectes, et sera un outil de recherche vasculaire puissant et robuste. Nous utilisons une approche d'imagerie optique qui marque thrombus avec un marqueur d'imagerie de thrombus moléculaire – un Cy5.5 fluorescent dans le proche infrarouge (NIRF) sonde qui est liée de manière covalente aux brins de fibrine du thrombus par l'action enzymatique de réticulation de la fibrine activée Xllla du facteur de coagulation pendant le processus de maturation du caillot. Un micro-tomographie par ordinateur (microCT) approche à base utilise des nanoparticules d'or thrombus recherche (AuNPs) fonctionnalisés pour cibler le composant principal du caillot: fibrine. Ce document décrit un protocole détaillé pour la combinaison in vivo et ex vivo microCT NIRF imagerie de thromboembolie dans un modèle de souris d'AVC embolique. Nous montrons que in vivo </ em> microCT et AuNPs de fibrine ciblées glycol-chitosane (fib-GC-AuNPs) peut être utilisé pour la visualisation des thrombus in situ et cérébral embolique thrombus aussi bien dans. Nous décrivons également l'utilisation d' un thrombus in vivo directe imagerie basée microCT pour surveiller en série les effets thérapeutiques de l' activateur tissulaire du plasminogène médiée par thrombolyse. Après la dernière session d'imagerie, nous démontrons par ex vivo NIRF imagerie de la mesure et de la distribution des thrombo – embolies résiduelle dans le cerveau. Enfin, nous décrivons l'image quantitative analyse des données d'imagerie microCT et NIRF. La technique combinée de l' imagerie de thrombus directe permet deux méthodes indépendantes de thrombus visualisation pour être comparés: la zone du signal fluorescent lié thrombus ex vivo sur NIRF imagerie par rapport au volume de hyperdense microCT thrombus in vivo.
Introduction
Une personne sur 6 aura un coup à un moment donné dans leur vie. L'AVC ischémique est de loin le type d'AVC le plus commun, et représente environ 80 pour cent de tous les cas d'AVC. Parce que thromboemboli causent la majorité de ces accidents vasculaires cérébraux ischémiques, il y a un intérêt croissant pour l'imagerie de thrombus direct.
Il a été estimé que près de 2 millions de cellules du cerveau meurent pendant chaque minute de l' occlusion de l' artère cérébrale moyenne 1, ce qui conduit au slogan «Time is Brain". La tomodensitométrie (TDM) des études peut être fait rapidement, et sont largement disponibles; pour cette raison, CT reste l'imagerie de choix pour le diagnostic et le traitement de l'AVC ischémique suraigu initial. CT est particulièrement utile pour informer les premières décisions critiques: l' administration de l' activateur tissulaire du plasminogène (tPA) pour thrombolyse et / ou triage à endovasculaire caillot recherche 2. thrombus actuelle imagerie à base de CT, cependant, ne peut pas suivre en série cerebral thromboembolies in vivo, car il utilise des méthodes indirectes pour démontrer thrombus: après opacification du pool sanguin par contraste iodés, les thrombus ont démontré que des défauts de remplissage dans les récipients. Il y a des limites dose et les risques associés à l'administration répétée de contraste iodés, qui ne permettent pas répétées imagerie de thrombus de cette manière.
Ainsi, il y a un besoin critique d'une méthode d'imagerie directe pour thrombus cérébrale chez les patients victimes d'AVC, afin de permettre plus rapidement et de meilleures décisions de traitement à effectuer. Nous vous proposons d'accomplir ceci en augmentant la valeur de CT, la modalité d'imagerie de première ligne actuellement utilisée pour la course, avec l'utilisation d'un agent d'imagerie moléculaire nanoparticulaire thrombus-recherche.
Nous avons démontré que l'utilisation de cet agent à l' aide de micro-tomographie par ordinateur (microCT), une haute résolution ex vivo ou in vivo (petit animal) version d'imagerie CT qui permet l' acquisition rapide de données <sup> 3,4. Même avec la relativement faible contraste des tissus mous disponibles pour les petites microCT des animaux (bien pire que disponible à partir de scanners de taille humaine), l'agent d'imagerie a été en mesure de rechercher et de marquer des thrombus en les rendant hyperdense sur CT, un «signe de vaisseau dense» renforcée par moléculaire imagerie.
En complément de la technique CT, notre groupe a déjà mis au point une technique d'imagerie de thrombus directe optique utilisant Cy5.5 fluorescent proche infrarouge (NIRF) sonde pour visualiser la charge de thrombus cérébrale 5. Ceci est une technique ex vivo sur des cerveaux post mortem, mais est très sensible, et sert à confirmer des données in vivo dans le cadre de la recherche.
Ayant à la fois CT et NIRF basés techniques d'imagerie thrombus recherche nous permet de comparer et de ces techniques pour obtenir des données très instructives sur le rôle de thrombus et d'imagerie de thrombus dans le processus de développement d'accident vasculaire cérébral ischémique.
Havant, nous décrivons un protocole détaillé d'une technique combinée de microCT in vivo et ex vivo NIRF imagerie pour visualiser directement thromboembolies dans un modèle de souris d'AVC embolique. Ces méthodes simples et robustes sont utiles pour faire progresser notre compréhension des maladies thrombotiques , en permettant l'exactitude de l'évaluation in vivo des thrombus charge / distribution et la caractérisation de l' évolution de thrombus dynamique d'une manière rapide et quantitative in vivo au cours du traitement, suivi par ex vivo des données qui sert comme le contrôle et la norme de référence pour la confirmation des résultats d'imagerie in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons démontré l'utilisation de deux techniques d'imagerie moléculaire complémentaires pour l' imagerie de thrombus directe dans des modèles expérimentaux d'AVC embolique: une fibrine or nanoparticule (fib-GC-AUNP) ciblées pour l' imagerie in vivo sur la base microCT, et un FXIIIa ciblé sonde d'imagerie optique pour ex vivo imagerie de fluorescence.
Après administration intraveineuse de FIB-GC-AuNPs thrombus est devenu visible au scanne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Corée Healthcare Technology R & D Project, Ministère de la Santé et des Affaires sociales (HI12C1847, HI12C0066), le Programme Bio & Medical Technology Development (2.010-0019862) et Laboratoire de recherche mondial (GRL) programme (NRF-2015K1A1A2028228) de la national Research Foundation, financée par le gouvernement coréen.
Materials
| Machines | |||
| microCT | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | |
| NIRF imaging system | Roper-scientific,Tucson, AZ | coolsnap-Ez | |
| Laser Doppler flowmeter | Perimed, Stockholm, Sweden | PeriFlux System 5000 | |
| Surgical microscope | Leica Microsystems, Seoul, Korea | EZ4HD | |
| Inhalation anesthesia machine | PerkinElmer, Massachusetts, USA | XGI-8 | |
| Software | |||
| NFR control | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | microCT control software |
| Lucion | Infinitt, Seoul, Korea | Lucion | 3D render imaging software |
| Lab chart 7 | ADInstruments, Colorado, USA | Lab chart 7 | rCBF |
| Image J software | Wanye Rasband, NIH, USA | 1.49d | imaging analysis |
| Devices/Instruments | |||
| Infusion pump | Harvard, Massachusetts, USA | pump 22(55-2226) | |
| Homeothermic blanket | Panlab, Barcelona, Spain | HB101 | |
| Pocket cautery | Daejong, Seoul, Korea | DJE-39 | |
| Brain matrice | Ted pella, CA, USA | 15003 | coronal section |
| PE-50 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-45(PE-50) | I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm |
| PE-10 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-10(PE-10) | I.D. 0.28mm O.D. 0.61 mm |
| 30 gauge needle | sungshim-medical, Seoul, Korea | ||
| Syringe | CPL-medical, Ansan, Korea | 1 & 3 cc | |
| Gauze | Panamedic, Cheonan, Korea | ||
| Tape | Scotch, Seoul, Korea | 3M-810 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 11253-27 | Dumont #L5 |
| Micro scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 15000-03 | Vannas spring |
| Scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 14084-08 | 8.5 cm |
| Black silk suture | Ailee, Busan, Korea | SK6071, SK728 | 6-0 and 7-0 |
| Reagents | |||
| meloxicam | Yuhan, Seoul, Korea | ||
| vet ointment | Novartis, Basel, Swiss | ||
| 10% Povidone-iodine (betadine) | Firson, Cheon-an, Korea | ||
| FeCl3 | Sigma, Missouri, United States | 157740-5G | |
| TTC | Amresco, Ohio, USA | 0765-100g | |
| Isoflurane | Hana-Pham, Gyeonggi, Korea | Ifran | 100 mL |
| PBS | Welgene, Daegu, Korea | LB001-02 | 500 mL |
| Gold nanoparticles | Synthesis | ||
| C15 optical agent | Synthesis | ||
| Tissue plasminogen activator | Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany | rtPA(actilyse) | 20 mg |
| Normal saline | Daihan Pham, Seoul, Korea | 48N3AF3 | 20 mL |
References
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