Dit protocol beschrijft de toepassing van gecombineerde nabij-infrarood fluorescerende (NIRF) beeldvorming en micro-computertomografie (microCT) voor het visualiseren van cerebrale thromboemboli. Deze techniek maakt de kwantificering van trombus last en evolutie. De NIRF beeldvormende techniek visualiseert fluorescent gelabelde trombus in weggesneden hersenen, terwijl de microCT techniek visualiseert trombus in levende dieren met behulp van goud-nanodeeltjes.
Direct trombus beeldvorming visualiseert de oorzaak van trombo-embolische infarct. In staat zijn om het trombus direct kunt veel beter onderzoek naar beroerte dan te vertrouwen op indirecte metingen, en zal een krachtige en robuuste vasculaire research tool zijn. We maken gebruik van een optische imaging aanpak die trombi met een moleculaire beeldvorming thrombus marker labels – Cy5.5 een nabij-infrarood fluorescerende (NIRF) probe die covalent is gekoppeld aan het fibrine strengen van de trombus door fibrine verknopen enzymatische werking van geactiveerde stollingsfactor XIIIa tijdens het proces van rijping stolsel. Een micro-computertomografie (microCT) gebaseerde benadering gebruikt trombus die goud nanodeeltjes (AuNPs) gefunctionaliseerd het hoofdbestanddeel van het stolsel targeten: fibrine. Dit document beschrijft een gedetailleerd protocol voor de gecombineerde in vivo microCT en ex vivo NIRF beeldvorming van thromboemboli in een muismodel van embolische beroerte. We tonen aan dat in vivo </ em> microCT en fibrine gerichte glycol-chitosan AuNPs (fib-GC-AuNPs) kan worden gebruikt voor het visualiseren van zowel in situ trombi en cerebrale embolie trombi. We beschrijven ook het gebruik van in vivo-microCT gebaseerde directe trombus beeldvorming serieel volgen de therapeutische effecten van weefsel plasminogeen-activator-gemedieerde trombolyse. Na de laatste opnamesessie tonen we de ex vivo NIRF beeldvorming van de omvang en van de resterende thromboemboli in de hersenen. Tot slot beschrijven we kwantitatief beeld analyses van microCT en NIRF beeldgegevens. De gecombineerde techniek van directe trombus beeldvorming kunnen twee onafhankelijke methoden trombus visualisatie te vergelijken: het gebied van trombus gerelateerde fluorescentiesignaal op ex vivo beeldvorming NIRF versus de hoeveelheid hyperdense microCT thrombi in vivo.
Een op de 6 mensen een beroerte op een bepaald punt in hun leven hebben. Herseninfarct veruit de meest voorkomende soort beroerte, en goed voor ongeveer 80 procent van alle beroertes. Omdat thromboemboli veroorzaken de meeste van deze ischemische beroerte, is er een toenemende belangstelling voor directe trombus beeldvorming.
Er werd geschat dat ongeveer 2 miljoen hersencellen sterven tijdens elke minuut van de middelste cerebrale slagader occlusie 1, wat leidt tot de slogan "Time is Brain". Computertomografie (CT) studies kunnen snel worden gedaan, en zijn overal verkrijgbaar; Daarom CT blijft de beeldvorming van de keuze voor de eerste diagnose en behandeling van hyperacute ischemische beroerte. CT is bijzonder waardevol voor het informeren van de kritieke eerste beslissingen: toedienen tissue plasminogen activator (tPA) voor trombolyse en / of triaging endovasculaire stolsel retrieval-2. Huidige CT-gebaseerde trombus beeldvorming, echter niet serieel volgen cerebral thromboemboli in vivo, omdat het gebruik maakt van indirecte methoden om trombi te tonen: na vertroebeling van het bloed zwembad bij jodiumhoudend contrastmiddel, worden de trombi aangetoond dat het vullen van defecten in de vaten. Er zijn dosislimieten en de risico's verbonden aan de herhaalde toediening van jodiumhoudend contrastmiddel, dat weg staan herhaalde beeldvorming van trombi op deze manier.
Er is derhalve een kritische behoefte aan een directe beeldvorming methode voor cerebrale trombi in patiënten met een beroerte, zodat snellere en betere behandeling beslissingen worden genomen. Wij stellen dit bereiken door verhogen van de waarde van CT, de momenteel gebruikte front beeldvormende modaliteit voor een beroerte, met behulp van een trombus die nanodeeltjes molecular imaging agens.
We hebben het gebruik van deze agent aangetoond met behulp van micro-computertomografie (microCT), een hoge-resolutie ex vivo of in vivo (kleine dieren) beeldvorming versie van CT die snelle data-acquisitie <toestaatsup> 3,4. Zelfs met de relatief slechte wekedelencontrast beschikbaar voor kleine dieren microCT (veel slechter dan die beschikbaar zijn vanaf menselijk formaat scanners), de imaging-agent was in staat om te zoeken en te markeren trombi door ze hyperdense op CT, een 'dichte vat sign' verbeterd door moleculaire beeldvorming.
Als aanvulling op de CT-techniek, heeft onze fractie eerder een optisch directe trombus beeldvormende techniek met behulp van Cy5.5 nabij-infrarood fluorescerende (NIRF) sonde naar cerebrale trombus last 5 visualiseren ontwikkeld. Dit is een ex vivo techniek op de post mortem hersenen, maar is zeer gevoelig, en dient te bevestigen in vivo data in het onderzoek setting.
Met zowel CT en NIRF gebaseerde trombus die beeldvormingstechnieken kunnen wij vergelijken en deze technieken zeer informatieve gegevens over de rol van trombus en trombus beeldvorming in het proces van ischemische beroerte ontwikkeling.
Here beschrijven we een gedetailleerd protocol van een gecombineerde techniek van in vivo microCT en ex vivo NIRF imaging direct thromboemboli visualiseren in een muismodel van embolische beroerte. Deze eenvoudige en robuuste werkwijzen bruikbaar voor ons begrip van trombotische ziekten bevorderen doordat de juiste in vivo bepaling van thrombus belasting / distributie en karakterisatie van dynamische trombus evolutie op een snelle en kwantitatieve wijze in vivo tijdens de behandeling, gevolgd door ex vivo gegevens die dient als een controle en referentiestandaard voor de bevestiging van in vivo beeldvorming bevindingen.
Wij toonden de toepassing van twee complementaire moleculaire beeldvorming technieken voor directe trombus beeldvorming in experimentele modellen van embolische beroerte: een fibrine gerichte gouden nanodeeltjes (fib-GC-AuNP) in vivo-microCT gebaseerde beeldvorming, en een FXIIIa gerichte optische afbeeldingssonde ex vivo fluorescentie beeldvorming.
Na intraveneuze toediening van fib-GC-AuNPs werd trombi zichtbaar CT als dichte structuren, veroorzaakt door de deeltjes ingev…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de Korea Healthcare Technology R & D Project, ministerie van Volksgezondheid en Welzijn (HI12C1847, HI12C0066), de Bio & Medical Technology Development Program (2010-0019862) en het programma Global Research Lab (GRL) (NRF-2015K1A1A2028228) van de National Research Foundation, gefinancierd door de Koreaanse regering.
Machines | |||
microCT | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | |
NIRF imaging system | Roper-scientific,Tucson, AZ | coolsnap-Ez | |
Laser Doppler flowmeter | Perimed, Stockholm, Sweden | PeriFlux System 5000 | |
Surgical microscope | Leica Microsystems, Seoul, Korea | EZ4HD | |
Inhalation anesthesia machine | PerkinElmer, Massachusetts, USA | XGI-8 | |
Software | |||
NFR control | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | microCT control software |
Lucion | Infinitt, Seoul, Korea | Lucion | 3D render imaging software |
Lab chart 7 | ADInstruments, Colorado, USA | Lab chart 7 | rCBF |
Image J software | Wanye Rasband, NIH, USA | 1.49d | imaging analysis |
Devices/Instruments | |||
Infusion pump | Harvard, Massachusetts, USA | pump 22(55-2226) | |
Homeothermic blanket | Panlab, Barcelona, Spain | HB101 | |
Pocket cautery | Daejong, Seoul, Korea | DJE-39 | |
Brain matrice | Ted pella, CA, USA | 15003 | coronal section |
PE-50 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-45(PE-50) | I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm |
PE-10 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-10(PE-10) | I.D. 0.28mm O.D. 0.61 mm |
30 gauge needle | sungshim-medical, Seoul, Korea | ||
Syringe | CPL-medical, Ansan, Korea | 1 & 3 cc | |
Gauze | Panamedic, Cheonan, Korea | ||
Tape | Scotch, Seoul, Korea | 3M-810 | |
Micro forceps | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 11253-27 | Dumont #L5 |
Micro scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 15000-03 | Vannas spring |
Scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 14084-08 | 8.5 cm |
Black silk suture | Ailee, Busan, Korea | SK6071, SK728 | 6-0 and 7-0 |
Reagents | |||
meloxicam | Yuhan, Seoul, Korea | ||
vet ointment | Novartis, Basel, Swiss | ||
10% Povidone-iodine (betadine) | Firson, Cheon-an, Korea | ||
FeCl3 | Sigma, Missouri, United States | 157740-5G | |
TTC | Amresco, Ohio, USA | 0765-100g | |
Isoflurane | Hana-Pham, Gyeonggi, Korea | Ifran | 100 mL |
PBS | Welgene, Daegu, Korea | LB001-02 | 500 mL |
Gold nanoparticles | Synthesis | ||
C15 optical agent | Synthesis | ||
Tissue plasminogen activator | Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany | rtPA(actilyse) | 20 mg |
Normal saline | Daihan Pham, Seoul, Korea | 48N3AF3 | 20 mL |