We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.
T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCRα and TCRβ chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.
קולטן תא T (TCR) הרפרטואר של בני אדם ועכברים כבר נאמד ב 1 x 10 8 ו -2 x 10 6 TCRs ייחודי בהתאמה 1,2. מגוון גדול זה מאפשר לתאי T להכיר מגוון רחב של אפיטופים אנטיגן נגזרו-פפטידים עצמיים וכן פתוגנים שהציג מורכבי histocompatibility הגדולים (MHC) על תאי מציגי אנטיגן (נגמ"שים). ההבדלים הדקים האינטראקציות של TCRs עם מתחמים ייחודיים פפטיד-MHC להכתיב אם תא T יעבור אפופטוזיס, anergy, הפעלה, בידול, ייצור ציטוקינים או רעיל. עם זאת, בשל רפרטואר TCR הגדול, ולנתח את ההשפעה של ספציפיות TCR יגיב אנטיגן מסוים מחייב שימוש יחיד מערכות TCR.
עכברים מהונדסים TCR שונים נוצרו על מנת ללמוד את הפונקציה של יחיד TCR במודל vivo ב 3-9. עם זאת, יש מספר אזהרות בנוגע TCR עכברים מהונדסים כוללעלות, את משך הזמן כדי ליצור עכבר מהונדס יחיד והשפעת המייסד שנקראת החדרת transgene האקראית לתוך ה- DNA germline 10. לכן, רק מעטים יחסית עכברים מהונדסים TCR נוצרו עבור כל אנטיגן נתון ואת ההשלכות הפונקציונליות של זיקת TCR גבוהה ונמוכה עבור אותו אפיטופ לעתים רחוקות מופנות. כדי לענות על הצורך בגישה מהירה למסך וללמוד מרובי TCRs בנפרד או במשולב, retrogenic ( 'רטרו' מ רטרו-וירוס ו 'genic' מ מהונדס) עכברים כבר נוצל כחלופת TCR עכברים מהונדסים 11-13.
מוטיב קונסנסוס פפטיד 2A נמצא בתוך כמה וירוסים מורכב 2A-Asp-Val / Ile-השפע-X-ASN-פרו-גלאי-2B-פרו, שבה מחשוף מתרחש בין גליצין של 2A ואת פרולין של 2B מפעילות hydrolase -acting ציס, וכתוצאה מכך מדלגים ריבוזומלי במהלך התרגום 10,14-16. לקבלת דיאגרמה מפורטת המתארת את גleavage של פפטידים 2A שונים (F2A, E2A, T2a ו P2A) עיין אזכור 10 – 12. באופן זה, 2 cistrons (אלפא ובטא TCR TCR) ניתן לקשר וכתוצאה מכך תרגום stoichiometric ב וקטור יחיד. ניצול גישה זו, אנו מסוגלים לבטא ישירות להשוות TCRs אנטיגן ספציפי מרובים in vivo.
בפרוטוקול, אנו שלבים קריטיים מספר בפירוט כדי להבטיח בריאות מח עצם אופטימלית, יעילות תמרה והרכבתה מחדש. השלב הקריטי הראשון הוא הדור ותחזוקה ראויה של תאים המפיק ויראלי GP + E86. השתמש שורות תאי מפיק פרקים מוקדמות ולשמור על 80% confluency או נמוך לפני שימוש. בעת ביצוע תאים טריים מ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ- NIH (5K22A1119151-01 ו 1R56DK104903-01) כדי MLB, תוכנית פיילוט / היתכנות של המכון לחקר סכרת (P30-DK079638) ב BCM, JDRF 1-FAC-2014-243-AN APF, ADA 1-15-JF-07, קריירה AAI באימונולוגיה אחוות כדי מגה, רוברט וג'ניס מקניר קרן.
DMEM, high glucose + glutamine | Corning Cellgro | 10-013-CV | Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate |
FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
Trypsin-Versene | Lonza | 17-161F | |
0.45 um syringe filter | Thermo Scientific | 194-2545 | |
polybrene | Sigma | H9268-10G | Sterile Filtered in dH2O |
Ciprofloxacin | VWR | AAJ61970-06 | |
5-fluorouracil (5-FU) | VWR | AAA13456-06 | |
Sodium Pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
MEM nonessential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
HEPES 1M solution | Corning Cellgro | 25-060-CI | |
2-Mercaptoethanol | Gibco by Life Technologies | 21985-023 | |
Pen/Strept | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
L-glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
150 mm tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
Tisue culture-treated 6-well flat plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
70 um nylon cell strainers | Falcon | 352350 | |
Mouse IL-3 | Invitrogen | PMC0033 | |
Human IL-6 | Invitrogen | PHC0063 | |
Mouse Stem Cell Factor | Invitrogen | PMC2113L | |
10x PBS | Corning Cellgro | 46-D13-CM | |
HANKS Buffer | Corning Cellgro | 21020147 | |
BD 10 mL Syringe | BD | 300912 | |
BD 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
27G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305109 | |
30G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305106 |