老化のヒトの疾患に関与する遺伝子を研究するために使用される遺伝子改変マウス用表現型レジメン
Summary
A reverse-genetics approach to understanding gene families associated with human disease is presented, using mouse as a model system, and the subsequent mouse phenotyping schedule is described. Because mice defective in a gene of interest, HtrA2, manifested Parkinsonian symptoms, the phenotyping regimen is focused on identifying neurological defects.
Abstract
Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to lessen the impact of debilitating conditions but remain elusive in many cases. Only by understanding the causes and pathology of diseases associated with aging, can scientists begin to identify potential therapeutic targets and develop strategies for intervention. The most common age-related conditions are neurodegenerative disorders such as Parkinson’s disease and blindness. Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in the elderly. Genome wide association studies have previously identified loci that are associated with increased susceptibility to this disease and identified two regions of interest: complement factor H (CFH) and the 10q26 locus, where the age-related maculopathy susceptibility 2 (ARMS2) and high-temperature requirement factor A1 (HtrA1) genes are located. CFH acts as a negative regulator of the alternative pathway (AP) of the complement system while HtrA1 is an extracellular serine protease. ARMS2 is located upstream of HtrA1 in the primate genome, although the gene is absent in mice. To study the effects of these genes, humanized knock-in mouse lines of Cfh and ARMS2, knockouts of Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 and HtrA4 as well as a conditional neural deletion of HtrA2 were generated. Of all the genetically engineered mice produced only mice lacking HtrA2, either systemically or in neural tissues, displayed clear phenotypes. In order to examine these mice thoroughly and systematically, an initial phenotyping schedule was established, consisting of a series of tests related to two main diseases of interest: AMD and Parkinson’s. Genetically modified mice can be subjected to appropriate experiments to identify phenotypes that may be related to the associated diseases in humans. A phenotyping regimen with a mitochondrial focus is presented here alongside representative results from the tests of interest.
Introduction
加齢関連疾患は、現代社会でますます普及してきています。医学が向上し、平均余命が増加すると、人口は年齢に続き、これらの疾患の負担が大きくなります。有効な治療法は衰弱させる条件の影響を軽減するために必要であるが、多くの場合、とらえどころのないまま。唯一の加齢に伴う疾患の原因と病態を理解することによって、科学者たちは、潜在的な治療標的を同定し、介入のための戦略を開発するために始めることができます。一般的な加齢関連状態は、パーキンソン病（PD）及び加齢性黄斑変性症（AMD）などの神経変性疾患が挙げられます。 PDは、ヒトにおいて神経変性によって引き起こされる最も一般的な運動障害です。ほとんどのPD患者は、年齢の50年後振戦、動作緩慢、剛性を休んなどの症状を示しています。早期発症はまた、症例の約10％において観察されています。
AMDは失明の主要な原因であります目の中の高齢者、漸進的にダメージを与える光受容体および網膜色素上皮（RPE）。中心視力が損なわが、周辺視野は、一般的に影響を受けません。 AMDの2つの形式があります。 「ドライ」の形式では、RPEとブルッフ膜（BM）との間のドルーゼンの形として知られている細胞外タンパク質の沈着は、地理的萎縮につながると中心視力のぼやけ。より深刻な「ウェット」フォームRPEと感光層へのBM全体の脈絡膜から新生血管形成の結果とは、網膜組織に永久的な損傷を引き起こす網膜の下にhamorrhagingにつながることができます。染色体1および10q26座、加齢性黄斑変性症の感受性2（ARMS2）との補体因子H（CFH）：ゲノムワイド関連研究では、以前にこの疾患に感受性の増加に関連付けられており、関心の2つの領域を同定された遺伝子座を同定しました高温要件因子A1（HTRA1）遺伝子が1-5位置しています</sup>。これらの対立遺伝子の組み合わせは、用量依存的にAMDの可能性を増加させ、特定のSNPを優先AMD 3-6の湿潤または乾燥形態のいずれかに関連付けることができます。
CFHはC3の活性化を阻害することによって補体系の代替経路（AP）の負の調節因子として作用します。一塩基多型（SNP）が原因でC置換1〜Tにヒスチジンとエクソン9におけるチロシン402の交換を引き起こし、AMDのリスクの増加に関連しています。 AMDでは、APが原因CFHの機能の喪失が、SNPは因果的役割は不明である果たしているかどうかを誤調節されると考えられています。 1つの仮説は、正に荷電したヒスチジンは、タンパク質C反応性タンパク質、およびヘパリン硫酸1,7相互作用に結合するCFHの能力を無効にすると考えられることである。CFH Y402Hのインビトロ研究は、変異体間の機能の違い上矛盾する結果を提供し、 中in vivoでの作業<EM> CFH – / –ヒトCFHを発現するマウスは、8進行中です。遺伝子は、マウスには存在しないもののARMS2は、霊長類ゲノムにおけるHTRA1の上流に位置します。 HTRA1は、セリンプロテアーゼであるが、ARMS2が不十分に特徴付けられます。 AMD関連遺伝子座におけるSNPの間の連鎖不均衡は、それが困難なこの地域の遺伝子の個々の突然変異のリスクへの寄与を決定するために作られましたが、最近の研究は、それが血管新生につながるというARMS2よりHTRA1の過剰発現があることが示唆されていると網膜下のタンパク質沈着9-11。しかし、この遺伝子座における遺伝子の近接は、ランダムに挿入された導入遺伝子を用いて研究することができないの相互作用を可能にすることができます。
AMDに加えて、セリンプロテアーゼのhtrAのファミリーは、多くのヒトの疾患に関連しています。すべてhtrAのタンパク質は、少なくとも1つのC末端PDZドメインに続くセリンプロテアーゼドメインを含みます。 HTRA1、HtrA3とHtrA4はグラムを共有しますシグナルペプチド、インスリン様成長因子結合ドメイン、カザールプロテアーゼインヒビタードメイン、セリンプロテアーゼドメインおよびPDZドメインからなるeatest相同性。 HtrA2は異なるミトコンドリア局在配列からなるN末端 、膜貫通ドメインおよびプロテアーゼおよびPDZドメイン12-16に続いてアポトーシス結合ドメインの阻害剤を持っています。哺乳類HTRA1は、そのプロテアーゼドメイン17-20の活性部位における基質誘導性のリモデリングによって調節され、HtrA2はまた、プロテアーゼ活性21を抑制するセリンプロテアーゼとPDZドメインの相互作用によって調節することができます。興味深いことに、PDZドメインはHtrA3 16と同様の規制を付与することが表示されません。 htrAのプロテアーゼはまた、外因性因子によって調節することができる。それは、最近HTRA1およびプロトポルフィリン22とHtrA2の間の調節的相互作用は、p38 MAPキナーゼの活性化によってリン酸化によって調節することができるが存在することが実証されましたPINK1依存的23で経路。マウスでのhtrAのファミリーの個々のメンバーの削除は、しかし、機械的な影響はほとんどが部分的に目に見える表現型の欠如に不明確である、文書化されています。
HTRA1は、タンパク質品質管理において重要な機能を果たしており、その制御ミスまたは変異は、関節炎、癌およびAMD 3,4,24-32のリスクの増加など、さまざまなヒト疾患と関連しています。加速中の非神経組織の結果から、その損失は33-37老化しつつ神経組織におけるHtrA2機能の喪失は、ヒトおよびマウスにおけるPDの表現型と関連しています。 HtrA3の調節不全は、子癇前症および癌38,39の特定の種類を含む、疾患に関連しています。アップレギュレーションHtrA4のは、子癇前症患者の胎盤で観察されているが、ノックアウトマウスは明白な表現型40,41は表示されません。いくつかのノックアウトマウスで観察された表現型の欠如がありましたhtrAのファミリーメンバー間の補償の結果であると仮定：それはHtrA4とHTRA1両方がHtrA4 41の削除時にHTRA1により補償を可能にする、タンパク質のTGF-Bファミリーと相互作用すると考えられています。同様に、HTRA1とHtrA3がドメイン相同性の高い学位を持っているので、それらが相補機能42を持っているかもしれないと考えられています。しかし、一般的なターゲット43を調節するために競合する、htrAのタンパク質は、部分的に拮抗的役割を有し得ることが示唆されています。
さらに、これらのリスクを調査するためには、3つのヒト化ノックインマウス系統が生成された要因。 CFH TM1（CFH * 9）jhohとCFH TM2（CFH * 9）jhohは 、CFH遺伝子のエキソン9はヒト相同体のエクソン9で置換されている。CFHのTM1（CFH * 9）jhohは、非疾患関連チロシンをコード化するにはY402H、リスク関連SNPを運ぶjhoh CFH TM2（CFH * 9）に対し、402位の残基、。に人間ARMS2シーケンスtm1jhoh ARMS2は HTRA1の上流領域を標的としました。以前34に記載されているように loxP隣接STOP配列遺伝子配列の上流に配置されなく含まUBICプロモーターの下流には、Rosa26遺伝子プロモーターの制御下でCreリコンビナーゼを発現する、OzCreマウスと交配することによって切除しました。加えて、これらのノックインライン、CFHおよびHTRA1（CFH tm1jhohとHTRA1のtm1jhoh）、ならびに他の既知のhtrAのファミリーメンバーの条件付きノックアウト対立遺伝子が生成されました：HtrA2（HtrA2のtm1jhoh）、HtrA3（HtrA3 のtm1jhoh）とHtrA4（ HtrA4のtm1jhoh）。エクソン3、HTRA1;生殖ノックアウトは、欠失は、フレームシフトおよび/ または活性ドメイン（CFHの削除を引き起こすように、loxP部位で特定のエキソンに隣接するように設計された動物にOzCreマウスを交配することによって作成されたエクソン2-3、HtrA2：エクソン2-4、HtrA3。エクソン3、HtrA4。エクソン4-6）34,41。また、34に記載されている、;ガラス転移温度（Tg（NES-CRE）1Kln / J HtrA2 FLOX）HtrA2の神経削除は、 ネスチンのプロモーターの制御下でCreリコンビナーゼを使用して削除しました。 HtrA2を欠くマウスのみ、いずれかの全身または神経組織では、パーキンソン病の表現型を呈する、明確な表現型を示しました。
関心のこれらの遺伝子のいくつかは、ミトコンドリア11,44-47に局在することが仮定されており、HtrA2の削除はパーキンソン表現型を生成し、ミトコンドリアと神経学を中心とした表現型の計画はここに記載されており、関心の試験からの代表的な結果が提供されているので、 。初期の表現型のスケジュールが2メインに関連する一連のテストからなる、設立された徹底的かつ系統的、加齢関連疾患の人間を調査するために製造し、遺伝的に改変マウスを調べるために興味のある疾患：AMDおよびパーキンソン。
Protocol
Representative Results
Discussion
堅牢な治療法は、ヒトの老化に関連した条件を衰弱させるの影響を制限するために必要な、しかし、彼らは多くの条件のためにとらえどころのないままにされています。潜在的な治療標的を識別し、介入のための戦略を開発するには、加齢に伴う疾患の原因や病態を最初に理解しなければなりません。ていないこれらの遺伝子は、以前にヒトでの研究で条件にリンクされている場合でも、興?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究のための資金は、シャクナゲ医療財団とイェール大学医学部ディーンの研究基金（JH）から来ました。私たちは行動実験のヘルプは博士クレアケーニッヒに感謝します。遺伝子操作したマウス系統はOzgene（パース、オーストラリア）で生成されました。
Materials
| Ethanol | Decon (Fisher Scientific) | 435541 | |
| 50 ml conical tube | Fisher Scientific | 1443222 | |
| cotton balls | Walmart | ||
| heat mat | Sunbeam | 0000756-500-000 | |
| Holding tray (ice cube tray) | Walmart | ||
| Electronic stopwatch | GOGO | PC396 | |
| Plexiglass box | constructed in workshop | 12" by 12" | |
| Vixia HF R400 Camcorder | Canon | 8155B004 | |
| 9oz Clear Cups | Walmart | ||
| 1/4 inch wire mesh | Home Depot | 204331884 (online) / 554219 (in store) | 12" by 12" |
| Bubble wrap | VWR | 470092-416 | |
| Straight specimen forceps | VWR | 82027-438 | |
| Fine-tip dissecting forceps | VWR | 82027-408 | |
| Fine scissors | VWR | 82027-578 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10x phosphate buffered saline pH 7.4 | American Bioanalytical | AB11072-04000 | |
| Sucrose | JT Baker | 4072-01 | |
| superfrost slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hematoxylin Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 353016 | |
| Eosin Y Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 2845-32 | |
| Tris hydrochloride | Sigma | T3253 | |
| Tris | American Bioanalytical | AB02000-01000 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate | Sigma | N8129 | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6876 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-05 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S2378 | |
| VectaMount aqueous mounting medium | Vector Labs | H-5501-60 | |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-545-M | 60 x 24 mm |
| AxioImager A1 microscope | Zeiss | ||
| Video camera tripod | Amazon | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fischer Scientific | 23730571 | |
| Cryostat Sectioning Machine | Leica | CM1900 | Discontinued but since replaced by CM1950 |
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