A reverse-genetics approach to understanding gene families associated with human disease is presented, using mouse as a model system, and the subsequent mouse phenotyping schedule is described. Because mice defective in a gene of interest, HtrA2, manifested Parkinsonian symptoms, the phenotyping regimen is focused on identifying neurological defects.
Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to lessen the impact of debilitating conditions but remain elusive in many cases. Only by understanding the causes and pathology of diseases associated with aging, can scientists begin to identify potential therapeutic targets and develop strategies for intervention. The most common age-related conditions are neurodegenerative disorders such as Parkinson’s disease and blindness. Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in the elderly. Genome wide association studies have previously identified loci that are associated with increased susceptibility to this disease and identified two regions of interest: complement factor H (CFH) and the 10q26 locus, where the age-related maculopathy susceptibility 2 (ARMS2) and high-temperature requirement factor A1 (HtrA1) genes are located. CFH acts as a negative regulator of the alternative pathway (AP) of the complement system while HtrA1 is an extracellular serine protease. ARMS2 is located upstream of HtrA1 in the primate genome, although the gene is absent in mice. To study the effects of these genes, humanized knock-in mouse lines of Cfh and ARMS2, knockouts of Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 and HtrA4 as well as a conditional neural deletion of HtrA2 were generated. Of all the genetically engineered mice produced only mice lacking HtrA2, either systemically or in neural tissues, displayed clear phenotypes. In order to examine these mice thoroughly and systematically, an initial phenotyping schedule was established, consisting of a series of tests related to two main diseases of interest: AMD and Parkinson’s. Genetically modified mice can be subjected to appropriate experiments to identify phenotypes that may be related to the associated diseases in humans. A phenotyping regimen with a mitochondrial focus is presented here alongside representative results from the tests of interest.
وبدأت الأمراض المرتبطة بالسن انتشارا في المجتمع الحديث. مع تحسن العلوم الطبية وزيادة متوسط العمر المتوقع، لا يزال السكان السن وعبء هذه الأمراض ينمو. هي العلاجات الفعالة الضرورية للتقليل من تأثير الظروف المنهكة ولكن لا تزال بعيدة المنال في كثير من الحالات. فقط من خلال فهم أسباب وعلم الأمراض من الأمراض المرتبطة بالشيخوخة يمكن للعلماء أن تبدأ في تحديد الأهداف العلاجية المحتملة ووضع استراتيجيات للتدخل. وتشمل الشروط المرتبطة بالعمر المشتركة الاضطرابات العصبية مثل مرض باركنسون (PD) والضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD). PD هو اضطراب الحركة الأكثر شيوعا التي تسببها التنكس العصبي في الإنسان. تظهر معظم المرضى PD أعراض مثل الراحة ورعاش، وبطء الحركة والتصلب بعد 50 سنة من العمر. كما لوحظ بداية مبكرة في ما يقرب من 10٪ من الحالات.
AMD هي السبب الرئيسي للعمى فيوكبار السن، وإلحاق أضرار تدريجيا المستقبلات الضوئية والظهارة الصبغية الشبكية (RPE) في العين. هو ضعف الرؤية المركزية ولكن الرؤية المحيطية لا يتأثر عموما. هناك نوعان من AMD. في شكل "الجافة"، والودائع بروتين الخلية المعروفة باسم شكل براريق شفافة بين RPE وغشاء بروك (BM)، مما أدى إلى ضمور الجغرافي وعدم وضوح الرؤية المركزية. وأشد "الرطب" نتائج النموذج من اتساع الأوعية الدموية من المشيمية عبر BM في RPE ومستقبلة للضوء طبقات ويمكن أن يؤدي إلى hamorrhaging تحت شبكية العين الذي يسبب تلف دائم في نسيج الشبكية. الجينوم الدراسات جمعية اسعة حددت سابقا مواضع التي ترتبط مع زيادة القابلية للإصابة بهذا المرض، وحددت منطقتين من الفائدة: عامل مكمل H (CFH) على كروموسوم 1 ومكان 10q26، حيث المرتبطة بالعمر اعتلال البقعة قابلية 2 (ARMS2) و ارتفاع في درجة الحرارة عامل شرط A1 تقع (HtrA1) الجينات 1-5 </sup>. مزيج من هذه الأليلات تزيد من احتمال AMD بطريقة تعتمد على الجرعة وتعدد الأشكال محددة يمكن أن تكون مرتبطة بشكل تفضيلي مع أي من أشكال رطبة أو جافة من AMD 3-6.
يعمل CFH كمنظم السلبية للمسار بديل (ا ف ب) من نظام المتممة التي تحول دون تفعيل C3. وقد تم ربط والنوكليوتيدات تعدد الأشكال واحد (SNP) إلى زيادة خطر الإصابة AMD، مما تسبب في تبادل التيروزين 402 في اكسون 9 مع الحامض الاميني بسبب T إلى C الاستبدال 1. في AMD يعتقد أن وكالة اسوشييتد برس هو misregulated بسبب فقدان وظيفة CFH لكن ما إذا كان يلعب SNP دور سببي غير واضح. فرضية واحدة هي أن الحامض الاميني موجبة الشحنة يعتقد أن ينفي قدرة CFH لربط التفاعل البروتينات بروتين سي التفاعلي وكبريتات الهيبارين 1،7. في الدراسات المختبرية من CFH Y402H توفر نتائج متضاربة بسبب خلافات الوظيفية بين المتغيرات، وفي فيفو العمل في <م> CFH – / – الفئران معربا عن أنسنة CFH هو مستمر 8. يقع ARMS2 المنبع HtrA1 في الجينوم الرئيسيات، على الرغم من أن الجين هو غائب في الفئران. HtrA1 هو الأنزيم البروتيني سيرين لكن يتميز ARMS2 سيئة. جعلت اختلال التوازن الربط بين تعدد الأشكال في موضع المرتبطة AMD-صعوبة في تحديد المساهمات في خطر التحولات الفردية من الجينات في هذه المنطقة، ولكن العمل الأخير قد اقترح أنه من overexpression من HtrA1 بدلا من ARMS2 أن يؤدي إلى اتساع الأوعية الدموية و ودائع البروتين تحت الشبكية 9-11. ومع ذلك، وعلى مقربة من الجينات في هذا الموضع قد تسمح لالتفاعلات التي لا يمكن دراستها باستخدام الجينات المحورة إدراجها بشكل عشوائي.
بالإضافة إلى AMD، ارتبط الأسرة HtrA البروتياز سيرين مع العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان. جميع البروتينات HtrA تحتوي على نطاق سيرين البروتيني تليها نطاق PDZ واحد على الأقل C-المحطة. HtrA1، HtrA3 وHtrA4 مشاركة غرامتأكل التماثل، ويتألف من مجال إشارة الببتيد، وعامل النمو الذي يشبه الانسولين ملزمة، مجال مثبط البروتياز Kazal، المجال سيرين البروتيني ومجال PDZ. HtrA2 لديه مختلفة N-محطة، ويتألف من سلسلة توطين الميتوكوندريا، مجال الغشاء والمانع من موت الخلايا المبرمج نطاق ملزم تليها البروتيني وPDZ المجالات 12-16. وينظم HtrA1 الثدييات من إعادة الناجم عن الركيزة في موقع نشط المجال البروتيني لها 17-20، ويمكن أيضا HtrA2 يكون منظم من قبل التفاعل بين البروتيني سيرين والمجالات PDZ أن يقمع النشاط البروتيني 21. ومن المثير للاهتمام، لا يظهر المجال PDZ للتشاور تنظيم مماثل لHtrA3 16. ويمكن أيضا أن البروتياز HtrA ينظم ذلك العوامل الخارجية: وقد تجلى ذلك مؤخرا أنه يوجد التفاعل التنظيمي بين HtrA1 وprotoporphyrins 22 و HtrA2 يمكن تنظيمها من قبل الفسفرة على تفعيل كيناز P38 MAPالمسار في الطريقة التي تعتمد على PINK1 23. وقد تم توثيق حذف كل فرد من أفراد الأسرة HtrA في الفئران، ولكن الآثار الميكانيكية هي في معظمها غير واضح ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود الظواهر المرئية.
HtrA1 يلعب وظيفة هامة في مراقبة الجودة البروتين وارتبط misregulation، أو طفرة مع العديد من الأمراض البشرية المختلفة بما في ذلك التهاب المفاصل والسرطان وزيادة خطر AMD 3،4،24-32. ارتبط فقدان وظيفة HtrA2 في الأنسجة العصبية مع الظواهر PD في البشر والفئران، في حين أن خسارتها من نتائج العينات غير العصبية في تسارع الشيخوخة 33-37. ارتبط التقلبات HtrA3 مع الأمراض بما فيها تسمم الحمل وأنواع معينة من السرطان 38،39. يصل التنظيم وقد لوحظ من HtrA4 في مشيمة من مرضى تسمم الحمل ولكن الفئران خروج المغلوب لا تعرض النمط الظاهري العلني 40،41. وكان عدم وجود الظواهر التي لوحظت في بعض الفئران خروج المغلوبيفترض أن يكون نتيجة للتعويض بين أفراد الأسرة HtrA: أنه يعتقد أن كلا HtrA4 وHtrA1 التفاعل مع الأسرة TGF-B من البروتينات، مما يسمح للتعويض من HtrA1 على حذف HtrA4 41. وبالمثل، ويعتقد أنه منذ HtrA1 وHtrA3 يكون حاصلا على درجة عالية من homologies نطاق قد يكون لديهم وظائف تكميلية 42. ومع ذلك، فقد قيل أن البروتينات HtrA قد أدوارا معادية جزئيا، وتنافس لتنظيم الأهداف المشتركة 43.
لمزيد من التحقيق في هذه عوامل الخطر تم إنشاء ثلاثة خطوط الماوس أنسنة المغلوب في. في CFH TM1 (CFH * 9) يتم استبدال jhoh وCFH TM2 (CFH * 9) jhoh، اكسون 9 من الجينات CFH مع اكسون 9 من نديد البشري. CFH TM1 (CFH * 9) jhoh بترميز التيروزين غير مرض المرتبط بقايا في موقف 402، في حين CFH TM2 (CFH * 9) jhoh يحمل Y402H، SNP المصاحب للخطر. فيARMS2 tm1jhoh تسلسل ARMS2 البشري والتي تستهدف منطقة المنبع من HtrA1. تم رفعه توقف تسلسل يحيط loxP ضعت المنبع من تسلسل الجين ولكن المصب من المروج UbiC شمل عن طريق عبور للفئران OzCre، التي تعبر عن لجنة المساواة العرقية recombinase تحت سيطرة المروج Rosa26، كما هو موضح سابقا (34). وبالإضافة إلى هذه الضربة القاضية في خطوط، تم إنشاء أليل خروج المغلوب الشرطية لCFH وHtrA1 (tm1jhoh وtm1jhoh HtrA1 CFH)، فضلا عن غيرهم من أفراد الأسرة HtrA المعروف: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh)، HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) وHtrA4 ( tm1jhoh HtrA4). تم إنشاء بالضربة القاضية خط الجرثومية من خلال عبور الفئران OzCre للحيوانات هندستها لتطويق الإكسونات محددة مع مواقع loxP، مثل أن حذف يسبب تحولا إطار و / أو حذف المجال النشط (CFH، اكسون 3، HtrA1، الإكسونات 2-3، HtrA2: الإكسونات 2-4، HtrA3. اكسون 3، HtrA4. الإكسونات 4-6) 34،41. وحذف العصبي للHtrA2، حذف باستخدام لجنة المساواة العرقية recombinase تحت سيطرة المروج Nestin (HtrA2 flox، تيراغرام (نيس-لجنة المساواة العرقية) 1Kln / J)، كما وصفت 34. الفئران الوحيدة التي تفتقر إلى HtrA2، إما بشكل منتظم أو في الأنسجة العصبية، عرض الظواهر واضحة، مع تقديم الظواهر الشلل الارتعاشي.
منذ وافترض بعض هذه الجينات التي تهم أن تكون مترجمة إلى الميتوكوندريا 11،44-47، وحذف HtrA2 إنشاء الظواهر الشلل الارتعاشي، وهو نظام phenotyping مع التركيز الميتوكوندريا والعصبية وصفها هنا ويتم تقديم نتائج ممثلة من الاختبارات ذات الاهتمام . من أجل دراسة فئران معدلة وراثيا تنتج لتحقيق الإنسان، وأمراض المرتبطة بالعمر شامل ومنهجي أنشئ جدول phenotyping الأولي، ويتكون من سلسلة من الاختبارات المتعلقة الرئيسيتينأمراض الفائدة: AMD والشلل الرعاش.
وهناك حاجة إلى علاجات فعالة للحد من تأثير المنهكة الظروف المتصلة بالشيخوخة الإنسان، ولكنها لا تزال بعيدة المنال بالنسبة لكثير من الظروف. لتحديد الأهداف العلاجية المحتملة ووضع استراتيجيات للتدخل، لا بد أولا من فهم أسباب وعلم الأمراض من الأمراض المرتبطة بالشيخوخة. ل…
The authors have nothing to disclose.
وجاء تمويل هذا البحث من المؤسسة الطبية دفلي نبات وصندوق أبحاث في كلية ييل الطبية العميد (JH). نشكر الدكتور كلير كونيغ للمساعدة في التجارب السلوكية. وراثيا تم إنشاؤها خطوط الماوس مهندسة في Ozgene (بيرث، أستراليا).
Ethanol | Decon (Fisher Scientific) | 435541 | |
50 ml conical tube | Fisher Scientific | 1443222 | |
cotton balls | Walmart | ||
heat mat | Sunbeam | 0000756-500-000 | |
Holding tray (ice cube tray) | Walmart | ||
Electronic stopwatch | GOGO | PC396 | |
Plexiglass box | constructed in workshop | 12" by 12" | |
Vixia HF R400 Camcorder | Canon | 8155B004 | |
9oz Clear Cups | Walmart | ||
1/4 inch wire mesh | Home Depot | 204331884 (online) / 554219 (in store) | 12" by 12" |
Bubble wrap | VWR | 470092-416 | |
Straight specimen forceps | VWR | 82027-438 | |
Fine-tip dissecting forceps | VWR | 82027-408 | |
Fine scissors | VWR | 82027-578 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
10x phosphate buffered saline pH 7.4 | American Bioanalytical | AB11072-04000 | |
Sucrose | JT Baker | 4072-01 | |
superfrost slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Hematoxylin Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 353016 | |
Eosin Y Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 2845-32 | |
Tris hydrochloride | Sigma | T3253 | |
Tris | American Bioanalytical | AB02000-01000 | |
Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate | Sigma | N8129 | |
Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6876 | |
Acetone | JT Baker | 9006-05 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390 | |
Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S2378 | |
VectaMount aqueous mounting medium | Vector Labs | H-5501-60 | |
Cover glass | Fisher Scientific | 12-545-M | 60 x 24 mm |
AxioImager A1 microscope | Zeiss | ||
Video camera tripod | Amazon | ||
Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fischer Scientific | 23730571 | |
Cryostat Sectioning Machine | Leica | CM1900 | Discontinued but since replaced by CM1950 |