Een Fenotypering regime voor genetisch gemodificeerde muizen gebruikt om genen die betrokken zijn in Human Ziekten van Aging Study
Summary
A reverse-genetics approach to understanding gene families associated with human disease is presented, using mouse as a model system, and the subsequent mouse phenotyping schedule is described. Because mice defective in a gene of interest, HtrA2, manifested Parkinsonian symptoms, the phenotyping regimen is focused on identifying neurological defects.
Abstract
Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to lessen the impact of debilitating conditions but remain elusive in many cases. Only by understanding the causes and pathology of diseases associated with aging, can scientists begin to identify potential therapeutic targets and develop strategies for intervention. The most common age-related conditions are neurodegenerative disorders such as Parkinson’s disease and blindness. Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in the elderly. Genome wide association studies have previously identified loci that are associated with increased susceptibility to this disease and identified two regions of interest: complement factor H (CFH) and the 10q26 locus, where the age-related maculopathy susceptibility 2 (ARMS2) and high-temperature requirement factor A1 (HtrA1) genes are located. CFH acts as a negative regulator of the alternative pathway (AP) of the complement system while HtrA1 is an extracellular serine protease. ARMS2 is located upstream of HtrA1 in the primate genome, although the gene is absent in mice. To study the effects of these genes, humanized knock-in mouse lines of Cfh and ARMS2, knockouts of Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 and HtrA4 as well as a conditional neural deletion of HtrA2 were generated. Of all the genetically engineered mice produced only mice lacking HtrA2, either systemically or in neural tissues, displayed clear phenotypes. In order to examine these mice thoroughly and systematically, an initial phenotyping schedule was established, consisting of a series of tests related to two main diseases of interest: AMD and Parkinson’s. Genetically modified mice can be subjected to appropriate experiments to identify phenotypes that may be related to the associated diseases in humans. A phenotyping regimen with a mitochondrial focus is presented here alongside representative results from the tests of interest.
Introduction
Leeftijdsgebonden ziekten worden steeds overwegend in de moderne samenleving. Als de medische wetenschap verbetert en de levensverwachting toeneemt, de bevolking steeds ouder en de last van deze ziekten groeit. Effectieve behandelingen zijn noodzakelijk om de gevolgen van de slopende omstandigheden te verminderen, maar blijven ongrijpbaar in veel gevallen. Alleen door inzicht in de oorzaken en pathologie van ziekten die samenhangen met het ouder worden kunnen wetenschappers beginnen om potentiële therapeutische doelen strategieën te identificeren en ontwikkelen voor interventie. Frequente leeftijdsgebonden aandoeningen omvatten neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson (PD) en leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD). PD is de meest voorkomende aandoening veroorzaakt door beweging neurodegeneratie bij mensen. De meeste PD patiënten vertonen symptomen zoals rust tremor, bradykinesie en stijfheid na 50 jaar. Early onset is ook waargenomen bij ongeveer 10% van de gevallen.
AMD is de belangrijkste oorzaak van blindheid bijouderen, geleidelijk beschadigen fotoreceptoren en het retinale pigmentepitheel (RPE) in het oog. Centrale visie is verminderd, maar de perifere zicht is over het algemeen niet beïnvloed. Er zijn twee vormen van AMD. In de "droge" vorm, extracellulaire eiwit deposito's bekend als drusen vorm tussen de RPE en Bruch's membraan (BM), wat leidt tot geografische atrofie en vervaging van de centrale visie. Hoe ernstiger "natte" vorm resultaten van neovascularisatie van het vaatvlies over BM in de RPE en fotoreceptorcellen lagen en kan leiden tot hamorrhaging onder de retina die permanente schade aan retinale weefsel veroorzaakt. Genome associatiestudies eerder geïdentificeerde loci die zijn geassocieerd met verhoogde gevoeligheid voor deze ziekte en die twee gebieden van belang: complement factor H (CFH) op chromosoom 1 en 10q26 locus, waarbij de leeftijdsgebonden macula degeneratie gevoeligheid 2 (ARMS2) en hoge temperatuur eis factor A1 (HtrA1) genen bevinden zich 1-5 </sup>. Combinaties van deze allelen de kans op AMD op een dosisafhankelijke wijze en specifieke SNPs kunnen bij voorkeur worden tezamen met de natte of droge vormen van AMD 3-6.
CFH fungeert als een negatieve regulator van de alternatieve route (AP) van het complementsysteem door remmen van de activering van C3. Een enkel nucleotide polymorfisme (SNP) is gekoppeld aan een verhoogd risico op AMD, waardoor uitwisseling van tyrosine 402 in exon 9 met histidine door een T naar C substitutie 1. AMD wordt aangenomen dat de AP misregulated door functieverlies van CFH maar of de SNP speelt een causale rol onduidelijk. Een hypothese is dat de positief geladen histidine Men denkt dat het vermogen van CFH te binden aan interagerende eiwitten C-reactief proteïne en heparine sulfaat 1,7 ontkrachten. In vitro studies CFH Y402H geven tegenstrijdige resultaten over functionele verschillen tussen de varianten, en vivo werk in <em> CFH – / – muizen die gehumaniseerd CFH is aan de gang 8. ARMS2 ligt stroomopwaarts van HtrA1 in het genoom primaten, hoewel het gen ontbreekt bij muizen. HtrA1 is een serine protease, maar ARMS2 is slecht gekarakteriseerd. De verbindingsevenwichtsafwijking tussen SNPs in de AMD-geassocieerde locus is het moeilijk om de bijdrage aan risico van individuele mutaties van de genen in deze regio te bepalen, maar recent werk heeft gesuggereerd dat het overexpressie van HtrA1 plaats ARMS2 die tot neovascularisatie en subretinale eiwit deposito's 9-11. Echter, de nabijheid van de genen in deze locus zorgen voor interacties die niet worden bestudeerd gebruikend willekeurig geplaatst transgenen.
Naast AMD is de HtrA van serine proteasen geassocieerd met vele menselijke ziekten. Alle eiwitten HtrA een serineprotease-domein gevolgd door ten minste één C-terminale PDZ-domein. HtrA1, HtrA3 en HtrA4 delen grdaarvan eet homologie bestaat uit een signaalpeptide, insuline-achtige groeifactor bindend domein, een Kazal proteaseremmer domein, het serineprotease-domein en een PDZ-domein. HtrA2 een andere N-terminus, bestaande uit een mitochondriaal lokalisatiesequentie, transmembraandomein en inhibitor van apoptose bindingsdomein gevolgd door het protease en PDZ-domeinen 12-16. HtrA1 zoogdieren wordt geregeld door substraat-geïnduceerde remodellering in de actieve plaats van het protease domein 17-20 en HtrA2 kan ook worden gemoduleerd door wisselwerking tussen het serine protease en PDZ-domeinen die proteaseactiviteit 21 onderdrukt. Interessant, heeft het PDZ-domein niet om soortgelijke regelgeving verlenen tegen HtrA3 16. De HtrA proteasen kan ook worden geregeld door extrinsieke factoren: het werd onlangs aangetoond dat er sprake is van een wettelijke interactie tussen HtrA1 en protoporfyrine 22 en HtrA2 kan worden gereguleerd door fosforylering bij activering van de p38 MAP kinaseroute in een PINK1 23 afhankelijke wijze. Het schrappen van individuele leden van de familie HtrA bij muizen is gedocumenteerd echter mechanistische effecten grotendeels onduidelijk mede door gebrek aan zichtbare fenotypen.
HtrA1 speelt een belangrijke rol in proteïne kwaliteitscontrole en misregulation of mutatie is geassocieerd met verschillende menselijke ziekten, waaronder artritis, kanker en een verhoogd risico op AMD 3,4,24-32. Verlies van HtrA2 functie in neurale weefsels is geassocieerd met PD fenotypes bij mensen en muizen, terwijl het verlies van niet-neurale weefsels leidt tot versnelde veroudering 33-37. HtrA3 ontregeling is geassocieerd met ziekten zoals pre-eclampsie en bepaalde vormen van kanker 38,39. Up-regulatie van HtrA4 waargenomen in de placenta van preëclampsie patiënten maar knockout muizen openlijk fenotype 40,41 niet weergegeven. Het gebrek aan fenotypen waargenomen bij sommige knockout muizen isverondersteld om een resultaat van de compensatie tussen de HtrA familielid: men denkt dat zowel HtrA4 en HtrA1 interactie met de TGF-B-familie van eiwitten, waardoor compensatie door HtrA1 na verwijdering van HtrA4 41. Ook wordt gedacht dat aangezien HtrA1 HtrA3 en hebben een hoge mate van homologie domein zij zullen complementaire functies 42 hebben. Er is echter gesuggereerd dat HtrA eiwitten gedeeltelijk antagonistische functies kan hebben, concurrerende gemeenschappelijke doelen 43 te regelen.
Om verder te onderzoeken deze risicofactoren drie gehumaniseerd knock-in muizen lijnen werden gegenereerd. In CFH TM1 (CFH * 9) jhoh en CFH TM2 (CFH * 9) jhoh, exon 9 van het CFH-gen wordt vervangen door exon 9 van de humane homoloog. CFH TM1 (CFH * 9) jhoh codeert voor de niet-ziekte geassocieerd tyrosine residu op positie 402, terwijl CFH TM2 (CFH * 9) jhoh de Y402H, risico's geassocieerd SNP draagt. InARMS2 tm1jhoh het menselijk ARMS2 sequentie werd gericht op een gebied stroomopwaarts van HtrA1. Een loxP-geflankeerd STOP sequentie stroomopwaarts van de gensequentie maar stroomafwaarts van de opgenomen UbiC promoter werd uitgesneden door kruising met OzCre muizen, die Cre recombinase onder de controle van de promoter Rosa26 expressie, zoals eerder beschreven 34. Naast deze knock-in lijnen voorwaardelijke knockout allelen CFH en HtrA1 (CFH tm1jhoh en HtrA1 tm1jhoh), evenals de andere bekende HtrA familieleden werden gegenereerd: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) en HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh). De kiem-lijn knockouts zijn gemaakt door kruising OzCre muizen dieren ontworpen om specifieke exons met loxP plaatsen, zodanig dat verwijdering veroorzaakt een frame shift en / of verwijdering van de actieve domein (CFH flank, exon 3, HtrA1; exons 2-3, HtrA2: exons 2-4, HtrA3; exon 3, HtrA4; Exons 4-6) 34,41. Een neuraal deletie van HtrA2, verwijderd met recombinase Cre onder controle van de promoter Nestin (HtrA2 flox, Tg (Nes-cre) 1Kln / J), is ook beschreven 34. Alleen muizen ontbreekt HtrA2, hetzij systemisch of in zenuwweefsel, weergegeven duidelijke fenotypes, presenteren met Parkinson fenotypes.
Aangezien sommige van deze genen van belang worden geponeerd worden gelokaliseerd mitochondria 11,44-47 en verwijdering van HtrA2 gegenereerd Parkinson fenotypen fenotypering een regime met een mitochondriale en neurologische focus is beschreven en representatieve resultaten van de tests van belang verricht . Om genetisch gemanipuleerde muizen geproduceerd mens, leeftijdsgebonden aandoening grondig onderzoek en systematisch werd een eerste fenotypering tijdschema die onderzoeken, die bestaat uit een reeks tests betreffende de tweeziekten van belang: AMD en Parkinson.
Protocol
Representative Results
Discussion
Robuuste behandelingen nodig om de gevolgen van de slopende aandoeningen die verband houden met menselijke veroudering te beperken, maar zij blijven ongrijpbaar voor veel aandoeningen. Om potentiële therapeutische targets te identificeren en strategieën voor interventie ontwikkelen, moet de oorzaken en pathologie van ziekten die samenhangen met veroudering eerst begrepen. Niet alle genetisch gemodificeerde muizen onmiddellijk duidelijk aanwezig met fenotypes die verband houden met de ziekte van belang, zelfs als die g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De financiering voor dit onderzoek kwam van Rosebay Medical Foundation en een Yale Medical School Dean's Research Fund (JH). Wij danken Dr. Claire Koenig voor hulp bij gedrags-experimenten. Genetisch gemanipuleerde muis lijnen gegenereerd op Ozgene (Perth, Australië).
Materials
| Ethanol | Decon (Fisher Scientific) | 435541 | |
| 50 ml conical tube | Fisher Scientific | 1443222 | |
| cotton balls | Walmart | ||
| heat mat | Sunbeam | 0000756-500-000 | |
| Holding tray (ice cube tray) | Walmart | ||
| Electronic stopwatch | GOGO | PC396 | |
| Plexiglass box | constructed in workshop | 12" by 12" | |
| Vixia HF R400 Camcorder | Canon | 8155B004 | |
| 9oz Clear Cups | Walmart | ||
| 1/4 inch wire mesh | Home Depot | 204331884 (online) / 554219 (in store) | 12" by 12" |
| Bubble wrap | VWR | 470092-416 | |
| Straight specimen forceps | VWR | 82027-438 | |
| Fine-tip dissecting forceps | VWR | 82027-408 | |
| Fine scissors | VWR | 82027-578 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10x phosphate buffered saline pH 7.4 | American Bioanalytical | AB11072-04000 | |
| Sucrose | JT Baker | 4072-01 | |
| superfrost slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hematoxylin Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 353016 | |
| Eosin Y Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 2845-32 | |
| Tris hydrochloride | Sigma | T3253 | |
| Tris | American Bioanalytical | AB02000-01000 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate | Sigma | N8129 | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6876 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-05 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S2378 | |
| VectaMount aqueous mounting medium | Vector Labs | H-5501-60 | |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-545-M | 60 x 24 mm |
| AxioImager A1 microscope | Zeiss | ||
| Video camera tripod | Amazon | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fischer Scientific | 23730571 | |
| Cryostat Sectioning Machine | Leica | CM1900 | Discontinued but since replaced by CM1950 |
References
- Klein, R. J., et al. Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 308, 385-389 (2005).
- Zareparsi, S., et al. Strong association of the Y402H variant in complement factor H at 1q32 with susceptibility to age-related macular degeneration. Am J Hum Genet. 77, 149-153 (2005).
- Yang, Z., et al. A variant of the HTRA1 gene increases susceptibility to age-related macular degeneration. Science. 314, 992-993 (2006).
- Dewan, A., et al. HTRA1 promoter polymorphism in wet age-related macular degeneration. Science. 314, 989-992 (2006).
- Francis, P. J., Zhang, H., Dewan, A., Hoh, J., Klein, M. L. Joint effects of polymorphisms in the HTRA1, LOC387715/ARMS2, and CFH genes on AMD in a Caucasian population. Mol Vis. 14, 1395-1400 (2008).
- Cameron, D. J., et al. HTRA1 variant confers similar risks to geographic atrophy and neovascular age-related macular degeneration. Cell Cycle. 6, 1122-1125 (2007).
- Herbert, A. P., et al. Structure shows that a glycosaminoglycan and protein recognition site in factor H is perturbed by age-related macular degeneration-linked single nucleotide polymorphism. J Biol Chem. 282, 18960-18968 (2007).
- Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor h prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged cfh knockout mice. Am J Pathol. 185, 29-42 (2015).
- Nakayama, M., et al. Overexpression of HtrA1 and exposure to mainstream cigarette smoke leads to choroidal neovascularization and subretinal deposits in aged mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 6514-6523 (2014).
- Liu, J., Hoh, J. Postnatal overexpression of the human ARMS2 gene does not induce abnormalities in retina and choroid in transgenic mouse models. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, 1387-1388 (2015).
- Kanda, A., et al. A variant of mitochondrial protein LOC387715/ARMS2, not HTRA1, is strongly associated with age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16227-16232 (2007).
- Zumbrunn, J., Trueb, B. Primary structure of a putative serine protease specific for IGF-binding proteins. FEBS Lett. 398, 187-192 (1996).
- Clausen, T., Southan, C., Ehrmann, M. The HtrA family of proteases: implications for protein composition and cell fate. Mol Cell. 10, 443-455 (2002).
- Nie, G. Y., Hampton, A., Li, Y., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. Identification and cloning of two isoforms of human high-temperature requirement factor A3 (HtrA3), characterization of its genomic structure and comparison of its tissue distribution with HtrA1 and HtrA2. Biochem J. 371, 39-48 (2003).
- Runyon, S. T., et al. Structural and functional analysis of the PDZ domains of human HtrA1 and HtrA3. Protein Sci. 16, 2454-2471 (2007).
- Glaza, P., et al. Structural and Functional Analysis of Human HtrA3 Protease and Its Subdomains. PLoS One. 10, e0131142. 10, e0131142 (2015).
- Dolmans, D. E., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3, 380-387 (2003).
- Grau, S., et al. Implications of the serine protease HtrA1 in amyloid precursor protein processing. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6021-6026 (2005).
- Lecha, M., Puy, H., Deybach, J. C. Erythropoietic protoporphyria. Orphanet J Rare Dis. 4, 19 (2009).
- Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chem Soc Rev. 40, 340-362 (2011).
- Li, W., et al. Structural insights into the pro-apoptotic function of mitochondrial serine protease HtrA2/Omi. Nat Struct Biol. 9, 436-441 (2002).
- Jo, H., Patterson, V., Stoessel, S., Kuan, C. Y., Hoh, J. Protoporphyrins enhance oligomerization and enzymatic activity of HtrA1 serine protease. PLoS One. 9, 115362 (2014).
- Bogaerts, V., et al. Genetic variability in the mitochondrial serine protease HTRA2 contributes to risk for Parkinson disease. Hum Mutat. 29, 832-840 (2008).
- Baldi, A., et al. The HtrA1 serine protease is down-regulated during human melanoma progression and represses growth of metastatic melanoma cells. Oncogene. 21, 6684-6688 (2002).
- Oka, C., et al. HtrA1 serine protease inhibits signaling mediated by Tgfbeta family proteins. Development. 131, 1041-1053 (2004).
- Chien, J., et al. A candidate tumor suppressor HtrA1 is downregulated in ovarian cancer. Oncogene. 23, 1636-1644 (2004).
- Grau, S., et al. The role of human HtrA1 in arthritic disease. J Biol Chem. 281, 6124-6129 (2006).
- Chien, J., et al. Serine protease HtrA1 modulates chemotherapy-induced cytotoxicity. J Clin Invest. 116, 1994-2004 (2006).
- Chien, J., Campioni, M., Shridhar, V., Baldi, A. HtrA serine proteases as potential therapeutic targets in cancer. Curr Cancer Drug Targets. 9, 451-468 (2009).
- Hara, K., et al. Association of HTRA1 mutations and familial ischemic cerebral small-vessel disease. N Engl J Med. 360, 1729-1739 (2009).
- Jones, A., et al. Increased expression of multifunctional serine protease, HTRA1, in retinal pigment epithelium induces polypoidal choroidal vasculopathy in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14578-14583 (2011).
- Vierkotten, S., Muether, P. S., Fauser, S. Overexpression of HTRA1 leads to ultrastructural changes in the elastic layer of Bruch’s membrane via cleavage of extracellular matrix components. PLoS One. 6, e22959 (2011).
- Strauss, K. M., et al. Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson’s disease. Hum Mol Genet. 14, 2099-2111 (2005).
- Patterson, V. L., et al. Neural-specific deletion of Htra2 causes cerebellar neurodegeneration and defective processing of mitochondrial OPA1. PLoS One. 9, 115789 (2014).
- Jones, J. M., et al. Loss of Omi mitochondrial protease activity causes the neuromuscular disorder of mnd2 mutant mice. Nature. 425, 721-727 (2003).
- Martins, L. M., et al. Neuroprotective role of the Reaper-related serine protease HtrA2/Omi revealed by targeted deletion in mice. Mol Cell Biol. 24, 9848-9862 (2004).
- Kang, S., et al. Loss of HtrA2/Omi activity in non-neuronal tissues of adult mice causes premature aging. Cell Death Differ. 20, 259-269 (2013).
- Dynon, K., et al. HtrA3 as an early marker for preeclampsia: specific monoclonal antibodies and sensitive high-throughput assays for serum screening. PLoS One. 7, e45956 (2012).
- Singh, H., et al. HtrA3 Is Downregulated in Cancer Cell Lines and Significantly Reduced in Primary Serous and Granulosa Cell Ovarian Tumors. J Cancer. 4, 152-164 (2013).
- Inagaki, A., et al. Upregulation of HtrA4 in the placentas of patients with severe pre-eclampsia. Placenta. 33, 919-926 (2012).
- Liu, J., Li, Y., Hoh, J. Generation and characterization of mice with a conditional null allele of the HtrA4 gene. Mol Med Rep. , (2015).
- Bowden, M. A., Di Nezza-Cossens, L. A., Jobling, T., Salamonsen, L. A., Nie, G. Serine proteases HTRA1 and HTRA3 are down-regulated with increasing grades of human endometrial cancer. Gynecol Oncol. 103, 253-260 (2006).
- Chen, Y. Y., et al. Functional antagonism between high temperature requirement protein A (HtrA) family members regulates trophoblast invasion. J Biol Chem. 289, 22958-22968 (2014).
- Fritsche, L. G., et al. Age-related macular degeneration is associated with an unstable ARMS2 (LOC387715) mRNA. Nat Genet. 40, 892-896 (2008).
- Beleford, D., Rattan, R., Chien, J., Shridhar, V. High temperature requirement A3 (HtrA3) promotes etoposide- and cisplatin-induced cytotoxicity in lung cancer cell lines. J Biol Chem. 285, 12011-12027 (2010).
- Hegde, R., et al. Identification of Omi/HtrA2 as a mitochondrial apoptotic serine protease that disrupts inhibitor of apoptosis protein-caspase interaction. J Biol Chem. 277, 432-438 (2002).
- Martins, L. M., et al. The serine protease Omi/HtrA2 regulates apoptosis by binding XIAP through a reaper-like motif. J Biol Chem. 277, 439-444 (2002).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008. 2008, (2008).
- Wahlsten, D. A developmental time scale for postnatal changes in brain and behavior of B6D2F2 mice. Brain Res. 72, 251-264 (1974).
- El-Khodor, B. F., et al. Identification of a battery of tests for drug candidate evaluation in the SMNDelta7 neonate model of spinal muscular atrophy. Exp Neurol. 212, 29-43 (2008).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
- Chance, B., Williams, G. R., Holmes, W. F., Higgins, J. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. V. A mechanism for oxidative phosphorylation. J Biol Chem. 217, 439-451 (1955).
- Kamo, N., Muratsugu, M., Hongoh, R., Kobatake, Y. Membrane potential of mitochondria measured with an electrode sensitive to tetraphenyl phosphonium and relationship between proton electrochemical potential and phosphorylation potential in steady state. J Membr Biol. 49, 105-121 (1979).
- Brown, G. C., Brand, M. D. Proton/electron stoichiometry of mitochondrial complex I estimated from the equilibrium thermodynamic force ratio. Biochem J. 252, 473-479 (1988).
