A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.
Ayrıca kantitatif PCR (q-PCR) olarak bilinen Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu çevre örneklerinde taksonomik ve fonksiyonel grupların gen bolluklarını ölçmek için mikrobiyal ekoloji yaygın olarak kullanılan bir araçtır. bir ters transkriptaz reaksiyonu (RT-Q-PCR) ile kombinasyon halinde kullanıldığında, aynı zamanda gen transkript ölçmek için kullanılabilir. Q-PCR reaksiyonunun üstel aşamasında PCR amplikonlarının kantifikasyonuna izin veren son derece hassas flüoresan tespit kimyaları kullanır. Bu nedenle, PCR reaksiyonunun plato fazında tespit 'son nokta' PCR ile ilişkili önyargı kaçınılır. Bir protokol PCR sağlanan gerçek zamanlı yoluyla kıyı çökelleri bakteriyel 16S rRNA genleri ve transkript ölçmek için. İlk önce, DNA içermeyen RNA hazırlanması için gerekli olan ek adımları da dahil olmak üzere, kıyı sediment, DNA ve RNA eş çıkarılması için bir yöntem olup, özetlenmiştir. İkincisi, 16S rRNA genleri ve tr ölçümü için bir adım-adım kılavuzQ-PCR ve RT-Q-PCR yoluyla ekstre nükleik asitlerden anscripts özetlenmiştir. Bu DNA ve RNA standart eğri yapımı için ayrıntıları içerir. mikrobiyal ekoloji RT-Q-PCR deneyleri kullanımı için önemli hususlar dahil edilmiştir.
Mikroorganizmalar biyosfer sürüş ekosistem işlevi köşe taşı vardır. Mikroorganizmaların çoğu 1 uncultured kalır. Bu nedenle moleküler temelli yaklaşımlar ortamında mikroorganizmaların çeşitliliği ve işlevi anlayışımızı ilerletmek için temeldir. Bu yaklaşımlara merkezi çevresel numune nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) kullanılarak, hedef genlerin daha sonra amplifikasyon.
DNA / RNA ekstraksiyonu ilk aşaması, mikrobik topluluk mevcut hücre duvarlarını lize arzu edilmeyen olmayan nükleik asit molekülleri (örn, bir organik ve inorganik maddeler) kaldırmak ve daha fazla alt analiz için çözelti içinde, DNA / RNA korumak amaçlamaktadır. Ticari çıkarma kitleri bir dizi de dahil olmak üzere literatürde 2,3,4,5 mevcut çeşitli seçenekler, arasında, Griffiths yöntemi 6 yaygın 7,8,9 kullanılır. Bu maliyet-etkin ve pabu hücrelerin lize bir boncuk yenerek adımı kullanan ve aynı zamanda DNA ve RNA kurtarma iken, böyle hümik asitler PCR inhibitörleri, co-çıkarma aza indirmek için gerekli adımları içermektedir olarak rticularly de sedimanlar için uygundur.
İkinci adım, ekstre nükleik asitlerden, örneğin, 16S rRNA taksonomik markör hedef genleri amplifiye etmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılmaktadır. Bu yaklaşım vardır ve uncharacterized mikrobiyal kara kutu 10,11 keşif kolaylaştırmaya devam ediyor. Ancak, son nokta PCR tabanlı yöntemler çeşitli sınırlamalara muzdarip olabilir önyargı mikrobiyal toplulukların 12 karakterizasyonu. doğru gen / transkript bolluklarını ölçmek için, aynı zamanda niceliksel PCR (qPCR) olarak bilinen gerçek-zamanlı PCR, kullanılmalıdır. qPCR PCR her döngüsünden sonra amplikon birikimini izlemek floresan raportör boya sistemleri patlatır. Bu miktar çok erken üslü fazda oluşabilir aracı olarak anlamlıdıramplikon de hedef genin başlangıç bolluğu ile doğru orantılıdır son nokta, PCR reaksiyonunun faz, daha.
İki raportör sistemler yaygın olarak kullanılmaktadır: Bir araya eklenen nükleik asit lekesi 13 ve DNA polimerazı 14 5 'den 3' ekzonükleaz aktivitesi. Eski raportör sistemi bütün çift-şeritli DNA'ya indistinctivelyi bağlandığından, istenmeyen, spesifik olmayan amplikonlar veya ürünler ile astar dimerler meydana gelmesi halinde, bu hedef dizinin fazla tahmin edilmesine yol açabilir. Bu önüne geçmek için, amplifikasyon kapsamlı optimizasyon gerekli olabilir. Daha sonraki bir sistemde, şablon amplifikasyonu bölen bir iç probtan bir flüorofor Taq polimeraz, 5 'nükleaz aktivitesi bir kombinasyonu kullanılarak izlenir. Bu özellik sayesinde, tamamlayıcı hedef spesifik sequenc sadece bağlanan bir florojenik prob kullanımına tahlilinin özgüllüğü artırırprimer çifti arasında e. her iki kimya ile miktar floresansta bir artış ile ölçüldüğü üzere PCR amplikonlarının birikimi önemli ölçüde eşiğe üzerinde geçme noktası (Cp) saptanmasıyla elde edilmektedir.
qPCR yoğun farklı ortamlarda 15 gen bolluklarını belirlemek için mikrobiyal ekoloji kullanılmıştır. Ayrıca, cDNA'ya RNA'nın ters transkripsiyon gen ekspresyonunu ölçmek için qPCR RT-qPCR ile birleştirilir. Bu nedenle, qPCR RT-qPCR çevresel numuneler içindeki gen ve / veya transkript numaralarının ölçümü için hızlı, etkili yöntemler temsil etmektedir.
Kıyı sedimanlarda Mikroorganizmalar organik madde mineralizasyonu, kirleticilerin bozulması ve azot 16,17,18 olarak macronutrients biyojeokimyasal bisiklet dahil olmak üzere çeşitli ekosistem süreçleri, sürücü. Bu dönüşümlerin ayrıntılı bir anlayış kapsamlı bir Accoun gerektirirGen ve transkript miktarlara nicel veriler dahil olmak üzere katkıda bulunan mikrobiyal nüfus, t. Burada kıyı çökelleri bakteriyel 16S rRNA geni ve transkript bolluk ölçümü için iyice test, akıcı ve standart bir dizi protokol tanıtmak. protokol, örnek toplama, eş zamanlı DNA ve RNA ekstraksiyonu, DNA-RNA serbest hazırlık, çıkarılan nükleik asitlerin kalite kontrolü, 16S rRNA-DNA ve -RNA standartları ve çevre örneklerinin miktarının nesil özetliyor. Burada anlatılan yöntemlerle elde edilen nicel veriler kıyı ekosistemlerinin sürüş mikrobiyal topluluklar üzerindeki ışık tutacak ihtiyaç vardır.
qPCR DNA / RNA ekstraksiyonu kombinasyonu gibi kıyı çökelleri gibi çevresel örneklerin, bir dizi gen ve transkript bolluk hassas ölçümü için hızlı, doğru, nispeten düşük maliyetli bir yöntem sağlar.
İlk nükleik asit ekstraksiyon 22 elde edilir mikrobiyal topluluk mevcut temsili bir görünüm sağlamak için kritik bir adımdır. Önleyici bileşikler (örneğin, humik asitler veya polifenolik a) Toplam hücre parçalama başarı, b) CO-ekstraksiyon) RNA fraksiyonu, C) kirletici DNA, d): sınırlamalar, ekstraksiyon protokolü için dikkate alınması gereken saklanan çıkarılan nükleik asitlerin hızlı bozulması. Önlemler bu sınırlamaları aşmak için alınmalıdır. Örneğin, özellikle bakım nükleik asitlerin ekstraksiyon örnek tipi (örneğin, sediment, toprak, atık su, vb için optimize olduğundan emin olmak için alınması gereken). DNA ve hem de RNA için nükleik asit verimi ve kalitesinde önemli ilerlemeler ön deneyler 23 gerçekleştirilmesi ile elde edilebilir. PCR bazlı uygulama 24 önleyici bileşiklerin etkisini en aza indirmek için, ekstre DNA ve RNA dilüsyonları bir dizi test edin. Birden çok dondurma-eritme çevrimleri elde edilen DNA / RNA hızlı bir şekilde ayrıştırılmaları aşmak ve -80 ° C 'de genetik bilginin kaybı, mağaza çok küçük hacimli alikotları önlemek için.
dikkatle, qPCR tasarlanmış zaman Sağlam, yüksek tekrarlanabilir ve hassas bir yöntemdir. Özellikle, bu protokolde belirtilen amplifikasyon ve standart eğri yapımı için yöntemler için diğer filogenetik belirteçleri (örneğin, arke 16S rRNA mantar 18S rRNA) ya da çevreye önemli fonksiyonları yer alan genlerin de içeren ilgili herhangi bir gen hedefi için adapte edilebilir. qPCR kullanımında bilinen sınırlamalar şunlardır: tekrarlanabilir yüksek kaliteli s) nesilMutlak ölçümü için tandard eğrisi, b) primer / prob seçimi ve Q-PCR Tayin koşullarının optimize edilmesi, c) düşük kaliteli / kesilmiş nükleik asitler, d), DNA / RNA çalışma seyreltisi seçimi kullanımı engellenmesini önlemek için . Ayrıca, qPCR tekniği hücre hesaplarına eşit olmayabilir geni / transkript bolluklarını sağlayan dikkate alınmalıdır: Mikroorganizmalar genomları ribozomal geni farklı kopya numaraları bu 16S ve 18S rRNA gen hedeflenen durumda, özellikle de bir 25.
Kalitesiz standart eğrileri ilgilenilen genin yanlış ölçümü neden olacaktır. Taze standart eğrileri yapılabilir hangi küçük alikotları yüksek konsantrasyon standartları stok saklamak için iyi bir uygulamadır. standart eğrileri tutmayın, her zaman en yüksek konsantrasyonda her zaman bir stok taze dilüsyonları yapmak. Çevresel örneklerin doğru ölçümü için stan konsantrasyonlarının aralığı sağlamakdard eğrisi bilinmeyen numunelerin beklenen Cp değerleri kapsar. transkript miktarının zaman iplikli DNA çift değil RNA standart eğri oluşturmak. Mümkün olduğunda, doğrudan karşılaştırılmasına örneklerinde miktar tayini Deneyler arası değişim 20 önlemek için tek bir tahlil içinde tamamlanmalıdır. Bu her zaman mümkün olmayabilir. Bu nedenle, tahliller arasında oluşan gen bolluklarını karşılaştırmak için tahliller arasında çoğaltılır örneklerin rastgele bir alt kümesi olması tavsiye edilir. Primer ve prob setleri geniş bir seçim anda qPCR mikrobiyal takson ve hedef grup için maksimum kapsama ve özgünlüğünü sağlamak için bu seçerken 15. Dikkatli göz gerekli fonksiyonel grupları hedef için kullanılabilir. Bir qPCR deneyinin Reaksiyon verimliliği tatmin edici değilse, sorun, EG ve / veya reaksiyon koşullarına (tavlama süresi ve / veya sıcaklık gibi), farklı termal döngü koşulları test primer prob konsantrasyonları ile başlar. OQ-PCR yöntemi ve reaksiyon koşulları optimize edilmiştir nce, her zaman uygun bir şablon konsantrasyonu belirlemek için, DNA / cDNA seyreltme aralığı bir başlangıç testi yapması gerekmektedir. Daha fazla tahliller için optimal şablon seyreltme en yüksek kopya sayısı ile sonuçlanan seyreltme aralığını seçin.
Şu anda, yeni nesil dizileme teknolojileri verimli ortamlar 26,27,28 bir bolluk mikrobiyal toplum yapısı ve fonksiyonları üzerine ışık tutacak. Ancak, bu veri kümeleri genellikle son nokta PCR amplikon kütüphaneleri dayanmaktadır ve bu nedenle belirli takson bolluğu sadece yarı-kantitatif değerlendirmeler sağlar. Dolayısıyla, gerçek zamanlı PCR tabanlı tekniğin yeteneği belirli taksonomik belirteçleri hedef (aşağı gerilme seviyesine yüksek etki alanından) yeni nesil dizileme ile elde edilen sonuçların verimli doğrulama sağlar. Ayrıca, qPCR başarılı şekilde stabil ISO başka mikrobik ekolojisi moleküler yöntemler ile bir arada kullanılmaktadıralkolik sondalama (SIP) veya filogenetik / fonksiyonel mikroarray'ler. Eski bir araç ile birlikte, qPCR metabolik olarak aktif bir topluluk 29,30 ölçmek için kullanılabilir. Mikroarray analizi ile kombine edildiğinde, qPCR ortamlarda 31,32 filogenetik belirteç tabanlı ve fonksiyonel gen araştırmalarının önemli nicel yorumunu sağlar.
Bu nedenle, ister tek başına ya da ekosistem işlevi diğer (çoğunlukla süreç tabanlı) değerlendirmeler ile birlikte kullanılır, kantitatif PCR mikrobiyal topluluklar ve ekosistem fonksiyonları arasında zor bağlantının keşif mikrobik ekolojistler için önemli bir araçtır.
The authors have nothing to disclose.
Bu yayın hibe sayısı NERC NE / JO11959 / 1 ve Bilim Vakfı İrlanda & CJS Grant Sayı 11 / SIRG / B2159awarded altında Marie-Curie Eylem COFUND altında Doğal Çevre Araştırma Konseyi (Merkezi tarafından) finansal desteği ile yürütülen araştırma kaynaklanmaktadır etti ve Doğu Academic Research Consortium (Doğu ARC).
Diethylpyrocarbonate | Sigma | 40718 | Toxic, open under chemical hood |
cetrimonium bromide (CTAB) | Sigma | 52365 | Irritant, open under chemical hood |
potassium phosphate dibasic | Sigma | RES20765 | |
potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol pH 8 | Sigma | P2069 | Equilibrate at pH 8 before using |
Chloroform:Isoamylalcohol | Sigma | 25666 | |
sodium chloride | VWR | 1.06404.0500 | |
polyethylenglycol 6000 | VWR | 528877-100 | |
Ethanol Molecular Grade | Sigma | E7148 | |
Lysing Matrix E tubes | MP Biomedical | 116914050 | |
Turbo DNAse | Ambion | AM1907 | |
Taq polymerase | Sigma | D1806 | |
dNTPs | Bioline | BIO-39028 | |
SuperScript III | Life Technologies | 18080044 | |
Rnase Inhibitor | Life Technologies | 10777019 | |
RNAse/DNAse free 0.2 ml PCR tubes | Sarstedt | 72.985.002 | |
SureCleanPlus | Bioline | BIO-37047 | |
pGEM Easy T Vector | Promega | A1360 | |
E. coli JM109 competent cells | Promega | L2005 | |
Tryptone | Sigma | T7293 | |
Yeast Extract | Sigma | 70161 | |
Ampicillin | Sigma | 59349 | |
X-Gal | Bioline | BIO-37035 | |
IPTG | Bioline | BIO-37036 | |
Agar | VWR | 20768.235 | |
Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
Qubit | Life Technologies | Q33216 | |
Quant-IT DNA HS Assay | Life Technologies | Q-33120 | |
Quant-IT RNA HS Assay | Life Technologies | Q32855 | |
MEGAshortscript kit | Ambion | AM1354 | |
TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84002 | |
qPCR machine |