A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.
Real-time PCR ook bekend als kwantitatieve PCR (Q-PCR) is een veel gebruikt instrument microbiële ecologie gen abundanties van taxonomische en functionele groepen in milieumonsters te kwantificeren. Gebruikt in combinatie met een reverse transcriptase reactie (RT-Q-PCR) kan ook worden gebruikt om gentranscripten kwantificeren. Q-PCR maakt gebruik van zeer gevoelige fluorescentiedetectie chemie die kwantificatie van PCR amplicons mogelijk te maken tijdens de exponentiële fase van de reactie. Daarom is de vooroordelen geassocieerd met "eindpunt" PCR gedetecteerd in de plateaufase van de PCR-reactie worden vermeden. Een protocol om bacteriële 16S rRNA genen en transcripten kustsedimenten kwantificeren via real-time PCR is aangebracht. Eerst wordt een werkwijze voor de co-extractie van DNA en RNA uit kustsedimenten, inclusief de aanvullende stappen voor de bereiding van DNA-vrije RNA wordt geschetst. Ten tweede, een stap-voor-stap voor de kwantificering van 16S rRNA genen en transcripts van de geëxtraheerde nucleïnezuren via Q-PCR en RT-Q-PCR is beschreven. Dit omvat informatie voor de constructie van DNA en RNA standaard curves. Essentiële aspecten voor het gebruik van RT-Q-PCR assays microbiële ecologie opgenomen.
Micro-organismen zijn de hoeksteen van de biosfeer rijden ecosysteemfunctie. De meeste micro-organismen blijven uncultured 1. Daarom moleculaire gebaseerde benaderingen zijn fundamenteel voor ons begrip van de diversiteit en de functie van micro-organismen in het milieu te bevorderen. Centraal in deze werkwijzen het extraheren van nucleïnezuren uit milieumonsters en de daaropvolgende amplificatie van doelgenen met behulp van de Polymerase Chain Reaction (PCR).
De eerste stap van DNA / RNA-extractie beoogt de celwanden van de microbiële gemeenschap onderhavige lyseren verwijderen ongewenste niet-nucleïne- zuurmoleculen (bijvoorbeeld organische en anorganische stoffen) en bewaar DNA / RNA in oplossing stroomafwaarts analyse. Tussen verschillende opties beschikbaar in de literatuur 2,3,4,5, waaronder diverse commerciële extractie kits wordt de werkwijze Griffiths 6 wijd toegepast 7,8,9. Het is kosteneffectief en particularly zeer geschikt voor sedimenten gebruikt een kraal slaan stap lyseren en neemt maatregelen om de co-extractie van PCR remmers, zoals humuszuren minimaliseren en tegelijkertijd terugwinnen van DNA en RNA.
De tweede stap maakt gebruik van de polymerasekettingreactie (PCR) om doelwitgenen, zoals de 16S rRNA taxonomische marker amplificeren, uit de geëxtraheerde nucleïnezuren. Deze aanpak heeft en blijft de verkenning van de uncharacterized microbiële black box 10,11 vergemakkelijken. Echter eindpunt PCR-gebaseerde methoden lijden aan verschillende beperkingen die kunnen vertekening van de karakterisering van microbiële gemeenschappen 12. Exact te kwantificeren gen / transcript abundanties moet real-time PCR, ook bekend als kwantitatieve PCR (qPCR) worden gebruikt. qPCR exploiteert fluorescente reporter kleurstof systemen amplicon accumulatie volgen na iedere cyclus van de PCR. Dit is belangrijk omdat daaruit kwantificering kan optreden tijdens de vroege exponentiële fase plaatsdan het eindpunt, fase van de PCR reactie, wanneer het amplicon opbrengst nog recht evenredig met de aanvankelijke overvloed van het doelwitgen.
Twee reportersystemen worden gewoonlijk gebruikt: een intercalerende nucleïnezuur vlek 13 en de 5 '3' exonuclease activiteit van het DNA polymerase 14. Aangezien de eerste reporter systeem indistinctively bindt aan alle dubbelstrengs DNA, kan dit leiden tot een overschatting van de doelsequentie als ongewenste niet-specifieke amplicons of primer dimeren bijproducten ontstaan. Om dit te omzeilen, kunnen uitgebreide optimalisering van amplificatie vereist. In het laatste systeem is sjabloon amplificatie gevolgd door een combinatie van een 5 'nuclease activiteit van Taq polymerase die splitst een fluorofoor vanuit een interne probe. Deze eigenschap verhoogt de specificiteit van de assay door het gebruik van een fluorogene sonde dat alleen bindt aan het complementaire doelwit-specifieke sequencere tussen het primerpaar. Met beide soorten verbindingen kwantificering wordt bereikt door het bepalen kruising punt (Cp) indien de accumulatie van PCR amplicons, zoals gemeten door een toename in fluorescentie, aanzienlijk boven achtergrondfluorescentie.
qPCR is uitgebreid gebruikt in microbiële ecologie gen abondantie bepalen in verschillende omgevingen 15. Bovendien wordt reverse transcriptie van RNA in cDNA gecombineerd met qPCR en RT-qPCR genexpressie te kwantificeren. Vandaar qPCR en RT-qPCR geven snelle, effectieve werkwijzen voor de kwantificering van genen en / of transcript nummers binnen milieumonsters.
Micro-organismen in kustsedimenten rijden diverse ecosysteem processen, met inbegrip van de mineralisatie van organische stof, de afbraak van verontreinigende stoffen en de biogeochemische cycli van macronutriënten zoals stikstof 16,17,18. Het volledige begrip van deze transformaties vereist een uitgebreide account van de bijdragende microbiële populaties, met inbegrip van kwantitatieve gegevens over gen en transcript abundanties. Hier introduceren we een reeks grondig getest, gestroomlijnde en gestandaardiseerde protocollen voor het kwantificeren van bacteriële 16S rRNA-gen en transcript abundanties in kustsedimenten. Het protocol beschrijft monstername, gelijktijdige DNA en RNA-extractie, DNA-RNA vrij voorbereiding, kwaliteitscontrole van de afgezogen nucleïnezuren, het genereren van 16S rRNA-DNA en RNA normen en kwantificering van milieu-monsters. Kwantitatieve gegevens afkomstig van de hier beschreven methoden nodig om licht te werpen op de microbiële gemeenschappen rijden kustecosystemen.
De combinatie van DNA / RNA extractie met qPCR verschaft een snelle, nauwkeurige en relatief kosteneffectieve methode voor de kwantificering van gevoelige gen en transcript abundanties van verschillende milieumonsters zoals kustsedimenten.
De eerste nucleïnezuur extractie is de kritische stap een representatief beeld van het onderhavige microbiële bereikt 22 waarborgen. Een aantal beperkingen moeten worden voor de extractie protocol: a) het bereiken van totale cellyse, b) co-extractie van remmende verbindingen (bijvoorbeeld humuszuren of polyfenolen), c) verontreinigend DNA in het RNA fractie, d) snelle afbraak van geëxtraheerde nucleïnezuren wanneer ze worden bewaard. Er moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen om deze beperkingen te omzeilen. Bijvoorbeeld bijzondere aandacht moet worden gezorgd dat de extractie van nucleïnezuren is geoptimaliseerd voor het type monster (bijvoorbeeld, sediment, grond, afvalwater, etc.). Significante verbeteringen in de nucleïnezuursynthese opbrengst en kwaliteit van zowel DNA als RNA kunnen worden bereikt door het uitvoeren van voorlopige experimenten 23. Om het effect van remmende verbindingen op PCR-gebaseerde toepassingen 24 minimaliseren, test een reeks verdunningen van het geëxtraheerde DNA en RNA. Om de snelle afbraak van het geëxtraheerde DNA / RNA van meerdere vries-dooicycli omzeilen en bij -80 ° C vermijden mogelijk verlies van genetische informatie, opslag meerdere kleine porties volume.
Bij zorgvuldig ontworpen, qPCR is een robuuste, zeer reproduceerbare en gevoelige methode. Met name kunnen de werkwijzen voor amplificatie en standaardcurve constructie die in dit protocol worden aangepast voor elk gen doelwit van belang, met inbegrip van andere fylogenetische markers (bijv Archaea 16S rRNA, 18S rRNA schimmel) of genen betrokken bij belangrijke functies in het milieu. Bekende beperkingen in het gebruik van qPCR zijn: a) de productie van reproduceerbare hoge-kwaliteit standard curve voor absolute kwantificering b) De keuze van primer / probes en optimalisatie van Q-PCR omstandigheden, c) het gebruik van lage kwaliteit / afgeschoven nucleïnezuren, d) De keuze van de werkverdunning van DNA / RNA inhibitie voorkomen . Bovendien moet worden overwogen dat qPCR techniek verschaft gen / transcript abundanties die niet gelijk kunnen stellen tellingen cel: Dit is vooral het geval wanneer 16S en 18S rRNA genen zijn gericht, zoals micro-organismen hebben verschillende kopie-aantallen van het ribosomale gen in hun genoom 25.
Slechte kwaliteit standaardcurven veroorzaakt onzuiver kwantificatie van het gen van belang. Het is een goede gewoonte om een voorraad van hoge concentratie normen in kleine porties waarvan het verse standaard curves kunnen worden gemaakt op te slaan. Niet standaard curves te slaan, altijd vers verdunningen van een voorraad van de hoogste concentratie per keer. Voor een nauwkeurige kwantificering van de milieu-monsters zorgen voor de reeks van concentraties van de standaard kromme overspant de verwachte Cp waarden van de onbekende monsters. Bij het kwantificeren van transcripten, de bouw van de standaard curve van RNA DNA niet verdubbelen. Als het mogelijk is, moet kwantificering van de monsters direct worden vergeleken binnen een enkele test worden voltooid om inter-assay variatie 20 vermijden. Dit kan niet altijd mogelijk zijn. Derhalve gen abundanties gegenereerd tussen assays vergelijken raadzaam om een willekeurige subset van monsters gerepliceerd tussen assays hebben. Een brede selectie van primer en probe sets zijn momenteel beschikbaar voor qPCR targeting microbiële taxa en functionele groepen 15. Een zorgvuldige afweging is nodig bij de keuze van deze voor zowel de maximale dekking en specificiteit voor de doelgroep te garanderen. Als de reactie-efficiëntie van een qPCR assay is niet bevredigend oplossen begint met het testen van verschillende thermale cycli condities (zoals annealing tijd en / of temperatuur) en / of reactieomstandigheden, bijvoorbeeld variërende primer-probe-concentraties. Once de Q-PCR-test en de reactieomstandigheden zijn geoptimaliseerd, altijd een eerste test van diverse DNA / cDNA verdunningen voeren om de juiste matrijsconcentratie bepalen. Selecteer de verdunningsreeks die het hoogste aantal kopieën als de optimale sjabloon verdunning voor verdere assays.
Op dit moment, next-generation sequencing technologieën efficiënt licht werpen op de microbiële gemeenschap structuur en functies in een overvloed aan omgevingen 26,27,28. Echter, deze datasets vaak gebaseerd op end-point PCR amplicon bibliotheken en daarom bieden enige semi-kwantitatieve beoordeling van de overvloed van bepaalde taxa. Vandaar dat de mogelijkheid van real time PCR-gebaseerde techniek om specifieke taxonomische markers richten (van hogere domein omlaag naar stamniveau) maakt een efficiënte validatie van de verkregen door next-generation sequencing resultaten. Bovendien qPCR is met succes gebruikt in combinatie met andere microbiële ecologie moleculaire technieken zoals iso stabieltope indringende (SIP) of historisch fenomeen / functionele microarrays. In combinatie met de voormalige tool kan qPCR worden gebruikt om het metabolisch actieve gemeenschap 29,30 kwantificeren. In combinatie met microarray-analyse, qPCR biedt belangrijke kwantitatieve interpretatie van fylogenetische-marker-based en functioneel gen enquêtes omgevingen 31,32.
Daarom, alleen of in combinatie met andere (vaak procesmatige) evaluaties van het ecosysteem van de functie gebruikt, kwantitatieve PCR is een essentieel instrument voor microbiële ecologen in de exploratie van de ongrijpbare band tussen microbiële gemeenschappen en ecosysteemfuncties.
The authors have nothing to disclose.
Deze publicatie is voortgekomen uit onderzoek uitgevoerd met de financiële steun van de Natural Environment Research Council (NERC) onder licentienummer NERC NE / JO11959 / 1 en Science Foundation Ierland en de Marie-Curie-actie COFUND onder Grant Number 11 / SIRG / B2159awarded naar CJS en de Oost-Academic Research Consortium (Oost-ARC).
Diethylpyrocarbonate | Sigma | 40718 | Toxic, open under chemical hood |
cetrimonium bromide (CTAB) | Sigma | 52365 | Irritant, open under chemical hood |
potassium phosphate dibasic | Sigma | RES20765 | |
potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol pH 8 | Sigma | P2069 | Equilibrate at pH 8 before using |
Chloroform:Isoamylalcohol | Sigma | 25666 | |
sodium chloride | VWR | 1.06404.0500 | |
polyethylenglycol 6000 | VWR | 528877-100 | |
Ethanol Molecular Grade | Sigma | E7148 | |
Lysing Matrix E tubes | MP Biomedical | 116914050 | |
Turbo DNAse | Ambion | AM1907 | |
Taq polymerase | Sigma | D1806 | |
dNTPs | Bioline | BIO-39028 | |
SuperScript III | Life Technologies | 18080044 | |
Rnase Inhibitor | Life Technologies | 10777019 | |
RNAse/DNAse free 0.2 ml PCR tubes | Sarstedt | 72.985.002 | |
SureCleanPlus | Bioline | BIO-37047 | |
pGEM Easy T Vector | Promega | A1360 | |
E. coli JM109 competent cells | Promega | L2005 | |
Tryptone | Sigma | T7293 | |
Yeast Extract | Sigma | 70161 | |
Ampicillin | Sigma | 59349 | |
X-Gal | Bioline | BIO-37035 | |
IPTG | Bioline | BIO-37036 | |
Agar | VWR | 20768.235 | |
Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
Qubit | Life Technologies | Q33216 | |
Quant-IT DNA HS Assay | Life Technologies | Q-33120 | |
Quant-IT RNA HS Assay | Life Technologies | Q32855 | |
MEGAshortscript kit | Ambion | AM1354 | |
TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84002 | |
qPCR machine |