A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.
Tempo reale Polymerase Chain Reaction noto anche come la PCR quantitativa (q-PCR) è uno strumento ampiamente utilizzato in ecologia microbica per quantificare abbondanze gene di gruppi tassonomici e funzionali in campioni ambientali. Usato in combinazione con una reazione di trascrittasi inversa (RT-q-PCR), può anche essere impiegato per quantificare trascritti genici. q-PCR sfrutta chimiche rilevazione fluorescente altamente sensibili che consentono la quantificazione degli ampliconi PCR durante la fase esponenziale della reazione. Pertanto, i pregiudizi associati 'end-point' PCR identificati nella fase di plateau della reazione PCR sono evitati. Un protocollo per quantificare batteriche geni 16S rRNA e trascrizioni da sedimenti costieri tramite PCR in tempo reale è fornito. Innanzitutto, un metodo per la co-estrazione di DNA e RNA da sedimenti costieri, tra i passaggi aggiuntivi necessari per la preparazione di RNA privo di DNA, è delineato. In secondo luogo, una guida passo-passo per la quantificazione dei geni 16S rRNA e TRanscripts dagli acidi nucleici estratti tramite q-PCR e RT-q-PCR è delineato. Ciò include informazioni per la costruzione di curve di DNA standard e RNA. Considerazioni chiave per l'uso di saggi di RT-q-PCR in ecologia microbica sono inclusi.
I microrganismi sono la pietra angolare della funzione biosfera ecosistema di guida. La maggior parte dei microrganismi rimangono uncultured 1. Pertanto approcci basati molecolari sono fondamentali per far progredire la nostra comprensione della diversità e della funzione dei microrganismi nell'ambiente. Al centro di questi approcci è l'estrazione di acidi nucleici da campioni ambientali e la successiva amplificazione di geni bersaglio mediante Polymerase Chain Reaction (PCR).
Il primo passo di estrazione di DNA / RNA propone di lisare le pareti cellulari della comunità microbica presente, rimuovere molecole nucleico-acido non indesiderate (sostanze esempio, organici e inorganici) e mantenere DNA / RNA in soluzione per ulteriori analisi valle. Tra le diverse opzioni disponibili in letteratura 2,3,4,5, tra cui una gamma di kit di estrazione commerciale, il metodo Griffiths 6 è largamente impiegato 7,8,9. E 'conveniente e particularly ben adatto a sedimenti in quanto utilizza una fase di stallonatura battere per lisare le cellule e incorpora misure per minimizzare la co-estrazione di inibitori della PCR, come gli acidi umici, mentre recuperando contemporaneamente DNA e RNA.
La seconda fase utilizza la reazione a catena della polimerasi (PCR) per amplificare geni bersaglio, come il marcatore tassonomica 16S rRNA, dagli acidi nucleici estratti. Questo approccio ha e continua a facilitare l'esplorazione del non caratterizzato microbica scatola nera 10,11. Tuttavia, i metodi end-point PCR basato soffrono di vari limitazioni che possono influenzare la caratterizzazione delle comunità microbiche 12. Per quantificare con precisione abbondanze gene / trascrizione, real-time PCR, noto anche come la PCR quantitativa (qPCR) deve essere utilizzato. qPCR sfrutta sistemi di colorante reporter fluorescenti che traccia accumulo amplicone dopo ogni ciclo della PCR. Ciò è significativo in quanto significa che la quantificazione può verificarsi durante la fase esponenziale precoce invecerispetto al punto finale, la fase della reazione PCR, quando la resa amplicone è ancora direttamente proporzionale all'abbondanza iniziale del gene bersaglio.
Due sistemi giornalista sono comunemente utilizzati: un intercalando macchia acido nucleico 13 e il 5 attività di '3' esonucleasi della DNA polimerasi 14. Dal momento che il precedente sistema giornalista si lega indistintamente a tutto il DNA a doppia elica, può portare ad una sovrastima della sequenza di destinazione se si verificano ampliconi non specifici indesiderati o dimeri di primer di prodotti. Per aggirare questo, può essere richiesto vasta ottimizzazione di amplificazione. In quest'ultimo sistema, modello di amplificazione viene monitorato utilizzando una combinazione di attività 5 'nucleasi di Taq polimerasi che fende un fluoroforo da una sonda interna. Questa caratteristica aumenta la specificità del test dovuta all'utilizzo di una sonda fluorogenica che si lega solo al complementari SEQUENC specifico bersaglioe tra la coppia di primer. Con entrambi chimiche quantificazione si ottiene determinando il valico (Cp) se l'accumulo di ampliconi PCR, come misurato da un aumento della fluorescenza, è significativamente superiore fluorescenza di fondo.
qPCR è stato ampiamente utilizzato in ecologia microbica per determinare le abbondanze di geni in diversi ambienti 15. Inoltre, la trascrizione inversa di RNA a cDNA è combinato con qPCR e RT-qPCR per quantificare l'espressione genica. Quindi, qPCR e RT-qPCR rappresentano veloci, metodi efficaci per la quantificazione del numero di geni e / o di trascrizione all'interno di campioni ambientali.
I microrganismi in sedimenti costieri auto vari processi ecosistemici, compresa la mineralizzazione della sostanza organica, la degradazione degli inquinanti e il cicli biogeochimici dei macronutrienti, come 16,17,18 azoto. La comprensione esaustiva di queste trasformazioni richiede un accoun completat dei contribuenti popolazioni microbiche, compresi i dati quantitativi sulle gene e la trascrizione abbondanze. Qui introduciamo una serie di accuratamente testati protocolli, semplificate e standardizzate per la quantificazione dei batteri di geni e la trascrizione abbondanze 16S rRNA nei sedimenti costieri. Il protocollo delinea la raccolta dei campioni, DNA simultanea e l'estrazione di RNA, la preparazione RNA privi di DNA, il controllo della qualità degli acidi nucleici estratti, generazione di 16S rRNA-DNA e gli standard -RNA e la quantificazione dei campioni ambientali. I dati quantitativi derivati dai metodi qui descritti sono necessari per far luce sulle comunità microbiche di guida ecosistemi costieri.
La combinazione di DNA di estrazione / RNA con qPCR fornisce un metodo rapido, preciso, relativamente conveniente per la quantificazione sensibile del gene e la trascrizione abbondanze da una serie di campioni ambientali, come ad esempio sedimenti costieri.
L'estrazione degli acidi nucleici iniziale è il passo fondamentale per garantire un quadro rappresentativo della comunità microbica presente si ottiene 22. Un certo numero di limitazioni devono essere considerati per il protocollo di estrazione: a) la realizzazione di lisi cellulare totale, b) co-estrazione di composti inibitori (ad esempio, acidi umici o polyphenolics), c) DNA contaminante nella frazione RNA, d) rapida degradazione degli acidi nucleici estratti se conservato. Precauzioni devono essere prese al fine di aggirare queste limitazioni. Ad esempio, particolare attenzione deve essere presa per assicurare che l'estrazione degli acidi nucleici è ottimizzato per il tipo di campione (ad esempio, sedimenti, suoli, acque di scarico, ecc). Miglioramenti significativi di resa di acido nucleico e la qualità sia per DNA e RNA possono essere realizzati effettuando esperimenti preliminari 23. Per ridurre al minimo l'effetto di composti inibitori su applicazioni basate sulla PCR 24, testare una serie di diluizioni del DNA estratto e RNA. Per aggirare la rapida degradazione del DNA / RNA estratto da più cicli di gelo-disgelo ed evitare la possibile perdita di informazioni genetiche, memorizzare più piccole aliquote di volume a -80 ° C.
Quando accuratamente progettato, qPCR è un metodo robusto, altamente riproducibile e sensibile. In particolare, i metodi per l'amplificazione e la costruzione curva standard descritte in questo protocollo può essere adattato per qualsiasi bersaglio gene di interesse, compresi gli altri marcatori filogenetici (vale a dire, archeali 16S rRNA, 18S rRNA fungine) o geni coinvolti in funzioni importanti per l'ambiente. Limitazioni nell'uso di qPCR sono: a) la generazione di riproducibile alta qualità sCurva tandard per la quantificazione assoluta, b) la scelta di primer / sonde e ottimizzazione delle condizioni di saggio q-PCR, c) l'uso di bassa qualità / acidi nucleici tranciate, d) la scelta della diluizione di lavoro di DNA / RNA per evitare l'inibizione . Inoltre, si deve considerare che la tecnica qPCR fornisce abbondanze gene / trascrizione che non può equiparare alla cella conta: questo è particolarmente vero quando i geni 16S e 18S rRNA sono mirati, come i microrganismi hanno diversi numero di copie del gene ribosomiale nel loro genoma 25.
curve standard di qualità poveri si tradurrà in quantificazione imprecisa del gene di interesse. E 'buona norma conservare uno stock di elevati standard di concentramento in piccole aliquote da cui curve standard freschi possono essere fatte. Non conservare le curve standard, sempre fare diluizioni fresche da uno stock di la più alta concentrazione di volta in volta. Per precisa quantificazione dei campioni ambientali assicurare la gamma di concentrazioni della stanCurva Dard abbraccia i valori Cp attesi dei campioni sconosciuti. Quando quantificazione trascrizioni, costruire la curva standard da RNA non DNA a doppio filamento. Quando possibile, la quantificazione dei campioni da confrontare direttamente dovrebbe essere completata entro un singolo test per evitare variabilità inter-saggio 20. Questo potrebbe non essere sempre possibile. Pertanto, per confrontare abbondanze di geni che si generano tra test è consigliabile avere un sotto-insieme casuale di campioni replicati tra i saggi. Un'ampia selezione di primer e sonda set sono attualmente disponibili per il targeting qPCR taxa microbica e gruppi funzionali è necessario 15. Una particolare attenzione nella scelta di questi al fine di garantire sia la copertura massima e specificità per il gruppo target. Se l'efficienza di reazione di un dosaggio qPCR non è soddisfacente, la risoluzione dei problemi inizia con test differenti condizioni di ciclo termico (come tempo di ricottura e / o temperatura) e / o condizioni di reazione, ad esempio, variando le concentrazioni primer sonda. OSNO le condizioni di analisi e di reazione q-PCR sono ottimizzati, effettuare sempre un test iniziale di una serie di diluizioni di DNA / cDNA per determinare la concentrazione modello appropriato. Selezionare l'intervallo di diluizione conseguente numero di copie più alto come la diluizione modello ottimale per ulteriori analisi.
Attualmente, le tecnologie di sequenziamento di prossima generazione capannone in modo efficiente luce sulla struttura delle comunità microbiche e funzioni in una pletora di ambienti 26,27,28. Tuttavia, questi insiemi di dati sono spesso basate su end-point PCR librerie ampliconi e quindi forniscono solo valutazioni semi-quantitative della abbondanza dei taxa particolare. Quindi, la capacità di tempo reale PCR basato a bersaglio specifici marcatori tassonomici (da alto dominio fino al livello di deformazione) permette la validazione efficace dei risultati ottenuti dal sequenziamento di prossima generazione. Inoltre, qPCR è stato utilizzato con successo in combinazione con altri metodi molecolari ecologia microbica quali ISO stabiletope sondare (SIP) o microarray filogenetici / funzionali. In combinazione con l'ex strumento, qPCR può essere utilizzato per quantificare la comunità metabolicamente attiva 29,30. In combinazione con l'analisi di microarray, qPCR fornisce chiave di interpretazione quantitativa dei marcatori-based e funzionale del gene filogenetici indagini ambienti 31,32.
Pertanto, utilizzato da solo o in combinazione con altri (spesso basate sui processi) valutazioni della funzione degli ecosistemi, la PCR quantitativa è uno strumento essenziale per ecologisti microbici nell'esplorazione del legame sfuggente tra le comunità microbiche e le funzioni dell'ecosistema.
The authors have nothing to disclose.
Questa pubblicazione ha emanato da una ricerca condotta con il sostegno finanziario del Natural Environment Research Council (NERC) con il numero concessione NERC NE / JO11959 / 1 e Science Foundation Ireland e la Marie-Curie Azione COFUND sotto Concessione Numero 11 / SIRG / B2159awarded a CJS e il Consorzio di ricerca accademica Orientale (ARC orientale).
Diethylpyrocarbonate | Sigma | 40718 | Toxic, open under chemical hood |
cetrimonium bromide (CTAB) | Sigma | 52365 | Irritant, open under chemical hood |
potassium phosphate dibasic | Sigma | RES20765 | |
potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol pH 8 | Sigma | P2069 | Equilibrate at pH 8 before using |
Chloroform:Isoamylalcohol | Sigma | 25666 | |
sodium chloride | VWR | 1.06404.0500 | |
polyethylenglycol 6000 | VWR | 528877-100 | |
Ethanol Molecular Grade | Sigma | E7148 | |
Lysing Matrix E tubes | MP Biomedical | 116914050 | |
Turbo DNAse | Ambion | AM1907 | |
Taq polymerase | Sigma | D1806 | |
dNTPs | Bioline | BIO-39028 | |
SuperScript III | Life Technologies | 18080044 | |
Rnase Inhibitor | Life Technologies | 10777019 | |
RNAse/DNAse free 0.2 ml PCR tubes | Sarstedt | 72.985.002 | |
SureCleanPlus | Bioline | BIO-37047 | |
pGEM Easy T Vector | Promega | A1360 | |
E. coli JM109 competent cells | Promega | L2005 | |
Tryptone | Sigma | T7293 | |
Yeast Extract | Sigma | 70161 | |
Ampicillin | Sigma | 59349 | |
X-Gal | Bioline | BIO-37035 | |
IPTG | Bioline | BIO-37036 | |
Agar | VWR | 20768.235 | |
Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
Qubit | Life Technologies | Q33216 | |
Quant-IT DNA HS Assay | Life Technologies | Q-33120 | |
Quant-IT RNA HS Assay | Life Technologies | Q32855 | |
MEGAshortscript kit | Ambion | AM1354 | |
TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84002 | |
qPCR machine |