Разработка и определение характеристик<em> In Vitro</em> Микрососудов Сеть и количественные измерения эндотелиальной [Са<sup> 2+</sup>]<sub> я</sub> И оксид азота Производство
Summary
Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.
Abstract
Эндотелиальные клетки (ЭКС) , выстилающие стенки кровеносных сосудов в естественных условиях постоянно подвергается воздействию потока, но культивированные КЭ часто выращиваются в статических условиях и проявляют провоспалительного фенотипа. Хотя развитие микрожидкостных устройств было охвачено инженерами в течение двух десятилетий, их биологические приложения остаются ограниченными. Более физиологически актуально в пробирке микрососудов модель подтверждено биологических применений имеет важное значение для продвижения поля и преодоления разрыва между в естественных условиях и в пробирке исследования. Здесь мы приводим подробные процедуры для развития культурной сети микрососудов с использованием микрожидкостных устройств с долгосрочной возможности перфузионной. Мы также продемонстрировать свои приложения для количественных измерений изменений агонист-индуцированного в ЕС я и оксид азота (NO) производства [2+] Ca в режиме реального времени с помощью конфокальной и обычной флуоресцентной микроскопии. Образовавшийся микрососудов нетторабота с непрерывной перфузии показали хорошо развитые перекрестки между КЧС. VE-кадгерина распределение был ближе к тому, что наблюдалось в интактных микрососудов, чем статически культивированных монослоев ЕС. АТФ-индуцированное кратковременное повышение в ЕС [Са 2+] и NO производства были количественно измерены на отдельных уровнях клеток, которые валидированных функциональность культивируемых микрососудов. Это устройство позволяет Микрожидкостных КЭ расти под хорошо контролируемым, физиологически соответствующего потока, что делает среда для культивирования клеток ближе к в естественных условиях , чем в обычных статичных 2D культур. Конструкция Микроканал сеть очень универсальна, а процесс изготовления прост и повторяемой. Устройство может быть легко интегрирован в конфокальной или обычной микроскопической системы, позволяющей с высоким разрешением изображения. Самое главное, потому что культивируют сеть микрососудов могут быть образованы первичными человеческими КЧС, этот подход будет служить полезным инструментом для исследования, какпатологически измененные компоненты крови из образцов пациентов влияют на человека ЭКС и обеспечить понимание клинических проблем. Она также может быть разработана в качестве платформы для скрининга лекарственных средств.
Introduction
Эндотелиальные клетки (ЭКС) , выстилающие стенки кровеносных сосудов в естественных условиях постоянно подвергается воздействию потока, но культивированные КЭ часто выращиваются в статических условиях и обладают провоспалительных фенотип 1,2. Технология микрофлюидики позволяет точно контролировать жидкость через геометрически ограниченных микромасштабная (суб-миллиметровом) каналов 3, что обеспечивает возможность для культивируемых клеток, особенно для сосудов КЧС, чтобы расти в желаемых условиях потока. Эти особенности делают условия культивирования клеток ближе к в естественных условиях , чем обычные статические 2D культур клеток. Они чрезвычайно важны, когда микрофлюидальные устройства используются для моделирования различных типов vasculatures и изучения реакции ЕС на механических и / или химических раздражений.
Несмотря на преимущества, которые показала сеть микроканалов над статической клеточной культуре, адаптации и применения микрофлюидики в биомедицинской FIELD остаются ограниченными. Об этом сообщает в недавнем обзоре, большинство публикаций этой области (85%) все еще находятся в инженерных журналах 4. Производительность микрофлюидальных устройств не было достаточно убедительным для большинства биологи, чтобы перейти от современных методов, таких как анализ Transwell и макромасштабной блюдо культуры / предметное стекло в этом миниатюрном устройстве. Микрофлюидикс представляет собой многопрофильную поля, которое требует междисциплинарного сотрудничества, чтобы переместить это поле вперед. Цель этой технической статьи состоит в том, чтобы уменьшить пробелы в знаниях между дисциплинами и сделать процедуры изготовления понятны биологи, обеспечивая при этом биологические приложения и функциональные проверки микрожидкостных микрососудов. Визуализированных экспериментальные протоколы включают изготовление обоих микрофлюидальных устройств и их биологических коммунальных услуг, что представляет собой тесное сотрудничество между инженерами и биологами.
Недавно мы сообщали некоторыебиологические приложения , использующие сети микрососудов в пробирке с микрожидком устройством 5. Для того, чтобы соответствующим образом спроектировать размеры сети микроканалов и вносящее желаемое напряжение сдвига, численная модель была построена с динамического переноса текучей среды программного обеспечения, чтобы внимательно оценить профиль потока. Первичные Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs) , которые были посеяны в микроканалов достижения слияния, т.е. охватывает всю внутреннюю поверхности микроканала, в течение 3-4 дней с непрерывной перфузии. Правильное формирование барьера была продемонстрирована VE-кадгерина окрашивания и по сравнению с теми, образуются в статических условиях культивирования клеток и в интактных микрососудов. Применяя экспериментальные протоколы , разработанные в индивидуальном порядке увлажненную неповрежденных микрососудов 6-8, мы количественно измеряли изменения в EC [Ca 2+] и оксид азота (NO) производства в ответ на аденозинтрифосфата (АТФ) с люминесцентными вdicators и конфокальной и обычные флуоресцентной микроскопии. Агонист-индуцированный рост EC [Ca 2+] и NO производства были представлены как необходимые внутриклеточные сигналы при воспалительных медиаторов , вызванной увеличением проницаемости микрососудов 6-15. Хотя некоторые предыдущие исследования показали изображения DAF-2 DA нагруженных микрофлюидальных устройств 16,17, соответствующее разрешение и анализ данных еще не достиг 18. Насколько нам известно, это исследование демонстрирует первые количественные измерения агонист-индуцированного динамического изменения в эндотелиальной я и NO производства с использованием Микрожидкостных системы на основе [2+ Ca].
Методы микротехнологий гибкость изготовить микроканалы до нескольких микрон и позволяют разрабатывать сложные схемы , чтобы имитировать геометрии микрососудов в естественных условиях. Здесь мы представили типичную сеть микроканальных с тремя уровнями ветвления. ЭтаСеть изготавливается с помощью комбинации фотолитографии, которая выполняется в микроструктур и чистом помещении мягкой литографии.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы приводим подробные протоколы для развития культурной сети микрососудов, характеристика переходов ЕС и цитоскелета F-актин распределения, а также количественные измерения EC [Ca 2+] и NO производства с использованием микрожидкостных устройств. Перфузировались Ми?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным сердца, легких и крови институт предоставляет HL56237, Национального института диабета, желудочно-кишечных и почечных заболеваний Институт DK97391-03, Национальный научный фонд (NSF-1227359 и EPS-1003907).
Materials
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A929 | |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31 AA | |
| Bovine Albumin | MP Biomedicals | 810014 | |
| Bovine Brain Extract (BBE) | Lonza | CC-4098 | |
| Cover-slip | Fisher Scientific | 12-542C | |
| DAF-2 DA | Calbiochem | 251505 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody | Life technologies | A-11055 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| DRAQ5 (nuclei staining) | Cell Signaling Technology | 4084 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | Sigma-Aldrich | E2759-15MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
| Fluo-4 AM | Life technologies | F-14201 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750-078 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-548B | |
| Glass Pasteur pippette | VWR | 14672 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | |
| HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2517 | |
| Isopropyl alcohol (IPA) | VWR | 89125 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-081 | |
| Mammalian Ringer Solution Ingredient | |||
| NaCl (132 mM) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| KCL (4.6 mM) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 · 2H2O (2.0 mM) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 ·7H2O (1.2 mM) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Glucose(5.5 mM) | Fisher Scientific | BP350-1 | |
| NaHCO3 (5.0 mM) | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Hepes Salt (9.1 mM) | Research Organics | 6007H | |
| Hepes Acid (10.9 mM) | Research Organics | 6003H | |
| MCDB 131 Culture Medium | Life technologies | 10372-019 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phalloidin (F-actin staining) | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 14040-133 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| Scalpel | Exel Int | 29552 | |
| Scotch tape | 3M | 34-8711-3070-3 | |
| Silicon wafer | VWR | 14672 | |
| SU-8 photoresist | MicroChem | SU-8 2050 Y111072 | |
| SU-8 developer | MicroChem | Y020100 | |
| tissue culture flasks | Sigma-Aldrich | Z707503-100EA | |
| Triton X-100 | Chemical Book | T6878 | |
| Trypsin Neutralizer solution | Gibco | R-002-100 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Gibco | R-001-100 | |
| Tubing | Cole-Parmer | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD | |
| VE-cadherin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6458 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar hood | NuAire | NU-425 Class II, Type A2 | |
| CCD camera | Hamamatsu | ORCA | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SL | |
| Desiccator | Bel-Art | F42022 | |
| Hotplate | Wenesco | HP-1212 | |
| Incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Isotemp oven | Barnstead | 3608-5 | |
| Lithography bench | Karl Suss | MA6 Contact Lithography | |
| Optical microscope | Nikon | L200 ND & Diaphod 300 | |
| Shutter for the CCD camera | Sutter Instrument | Lambda 10-2 | |
| Plasma cleaner | PVA TePla/Harrick plasma | M4L/PDC-32G | |
| Spin coater | Brewer Science | Cee 200X | |
| Syringe pump system | Harvard Apparatus | 703005 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD 2015 | |
| CFD simulation software | COMSOL | COMSOL Multiphysics 4.0.0.982 | |
| Images acquire and analyse for NO production | Universal Imaging | Metafluor |
References
- Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
- Michel, C. C., Curry, F. E. Microvascular permeability. Physiol Rev. 79, 703-761 (1999).
- Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater Today. 8, 50-56 (2005).
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507, 181-189 (2014).
- Li, X., Xu, S., He, P., Liu, Y. In vitro recapitulation of functional microvessels for the study of endothelial shear response, nitric oxide and [Ca2+]I. PLoS One. 10, 0126797 (2015).
- He, P., Pagakis, S. N., Curry, F. E. Measurement of cytoplasmic calcium in single microvessels with increased permeability. Am J Physiol. 258, 1366-1374 (1990).
- Zhou, X., He, P. Improved measurements of intracellular nitric oxide in intact microvessels using 4,5-diaminofluorescein diacetate. Am J Physiol-Heart C. 301, 108-114 (2011).
- Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of Applied Physiology. 113, 1110-1120 (2012).
- He, P., Zhang, X., Curry, F. E. Ca2+ entry through conductive pathway modulates receptor-mediated increase in microvessel permeability. Am J Physiol. 271, 2377-2387 (1996).
- Zhou, X., He, P. Endothelial [Ca2+]i and caveolin-1 antagonistically regulate eNOS activity and microvessel permeability in rat venules. Cardiovasc Res. 87, 340-347 (2010).
- Zhu, L., He, P. Platelet-activating factor increases endothelial [Ca2+] i and NO production in individually perfused intact microvessels. Am J Physiol-Heart C. 288, 2869-2877 (2005).
- He, P., Curry, F. E. Depolarization modulates endothelial cell calcium influx and microvessel permeability. Am J Physiol. 261, 1246-1254 (1991).
- He, P., Curry, F. E. Endothelial cell hyperpolarization increases [Ca2+]i and venular microvessel permeability. J Appl Physiol. 76 (1985), 2288-2297 (1994).
- Xu, S., Zhou, X., Yuan, D., Xu, Y., He, P. Caveolin-1 scaffolding domain promotes leukocyte adhesion by reduced basal endothelial nitric oxide-mediated ICAM-1 phosphorylation in rat mesenteric venules. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305, 1484-1493 (2013).
- Zadeh, M. H., Glass, C. A., Magnussen, A., Hancox, J. C., Bates, D. O. VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial Cells In Vitro are Inhibited by Dominant Negative TRPC6. Microcirculation. 15, 605-614 (2008).
- Tsai, M., et al. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of clinical investigation. 122, 408-418 (2012).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13, 1489-1500 (2013).
- D’Amico Oblak, T., Root, P., Spence, D. M. Fluorescence monitoring of ATP-stimulated, endothelium-derived nitric oxide production in channels of a poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic device. Analytical chemistry. 78, 3193-3197 (2006).
- Zhou, X. P., Yuan, D., Wang, M. X., He, P. N. H2O2-induced endothelial NO production contributes to vascular cell apoptosis and increased permeability in rat venules. Am J Physiol-Heart C. 304, 82-93 (2013).
- Lee, P. J., Hung, P. J., Rao, V. M., Lee, L. P. Nanoliter scale microbioreactor array for quantitative cell biology. Biotechnol Bioeng. 94, 5-14 (2006).
- Zakrzewicz, A., Secomb, T. W., Pries, A. R. Angioadaptation: Keeping the Vascular System in Shape. Physiology. 17, 197-201 (2002).
- Lipowsky, H. H., Kovalcheck, S., Zweifach, B. W. The distribution of blood rheological parameters in the microvasculature of cat mesentery. Circulation Research. 43, 738-749 (1978).
- Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr Biol (Camb). 7, 525-533 (2015).
- McCann, J. A., Peterson, S. D., Plesniak, M. W., Webster, T. J., Haberstroh, K. M. Non-uniform flow behavior in a parallel plate flow chamber : alters endothelial cell responses. Ann Biomed Eng. 33, 328-336 (2005).
- Curry, F. E. Modulation of venular microvessel permeability by calcium influx into endothelial cells. FASEB J. 6, 2456-2466 (1992).
- Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).
- Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).
- Myers, D. R., et al. Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases. J Vis Exp. , (2012).
- Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks. Jove-J Vis Exp. , e51025 (2014).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB). Lab on a Chip. 12, 5282-5282 (2012).
- Shao, J. B., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).
- Yeon, J. H., et al. Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures. Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).
- Golden, A. P., Tien, J. Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element. Lab Chip. 7, 720-725 (2007).
- Zheng, Y., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).
- Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients. Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).
