Développement et caractérisation de<em> In vitro</em> Microvaisseaux réseau et des mesures quantitatives de l'endothélium [Ca<sup> 2+</sup>]<sub> i</sub> Et production d'oxyde nitrique
Summary
Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.
Abstract
Les cellules endothéliales (EC) qui tapissent les parois des vaisseaux sanguins in vivo sont constamment exposés à l' écoulement, mais CEs cultivées sont souvent cultivées dans des conditions statiques et présentent un phénotype pro-inflammatoire. Bien que le développement de dispositifs microfluidiques a été adopté par les ingénieurs plus de deux décennies, leurs applications biologiques restent limitées. Un modèle in vitro plus physiologiquement pertinents dans des microvaisseaux validées par des applications biologiques est important pour faire avancer le terrain et combler les lacunes entre in vivo et in vitro des études. Ici, nous présentons des procédures détaillées pour le développement du réseau de microvaisseaux cultivées en utilisant un dispositif microfluidique avec une capacité de perfusion à long terme. Nous démontrons également ses applications pour des mesures quantitatives de changements induits par un agoniste de la CE [Ca2 +] i et de l' oxyde nitrique (NO) la production en temps réel en utilisant la microscopie confocale et de fluorescence conventionnelle. Le filet de microvaisseaux formétravail avec perfusion continue a montré des jonctions bien développées entre CEs. la distribution VE-cadhérine était plus proche de celle observée dans les microvaisseaux intacts que monocouches CE statiquement cultivées. ATP-induit des augmentations transitoires CE [Ca2 +] i et la production de NO ont été quantitativement mesurée à des niveaux de cellules individuelles, qui a validé la fonctionnalité des microvaisseaux de culture. Ce dispositif microfluidique permet ECs de croître sous un flux physiologiquement pertinente bien contrôlée, ce qui rend l'environnement de culture cellulaire plus proche de in vivo que dans les cultures, 2D statiques classiques. La conception du réseau de microcanaux est très polyvalent, et le processus de fabrication est simple et reproductible. Le dispositif peut être facilement intégré au système microscopique confocale ou conventionnelle permettant l'imagerie haute résolution. Plus important encore, parce que le réseau de microvaisseaux de culture peut être formé par CEs humaines primaires, cette approche servira comme un outil utile pour étudier commentpathologiquement modifiés composants sanguins à partir d'échantillons de patients affectent CEs humaines et permettent de mieux comprendre les problèmes cliniques. Il peut également être mis au point en tant que plate-forme pour le criblage de médicaments.
Introduction
Les cellules endothéliales (EC) qui tapissent les parois des vaisseaux sanguins in vivo sont constamment exposés à l' écoulement, mais CEs cultivées sont souvent cultivées dans des conditions statiques et présentent un phénotype pro-inflammatoire 1,2. La technologie microfluidique permet à un fluide régulé avec précision à travers un micro – géométrie contrainte (inférieure au millimètre) , les canaux 3, ce qui offre la possibilité aux cellules mises en culture, en particulier pour vasculaires endothéliales, de croître sous des conditions d'écoulement désirées. Ces caractéristiques rendent les conditions de culture cellulaire plus proche in vivo que les cultures classiques, des cellules 2D statique. Ils sont extrêmement importants lorsque les dispositifs microfluidiques sont utilisés pour modéliser différents types de systèmes vasculaires et d'étudier les réponses des CE aux stimulations mécaniques et / ou chimiques.
En dépit des avantages démontrés par le réseau de micro-canaux sur une culture cellulaire statique, l'adaptation et l'application de la microfluidique dans le f biomédicalield restent limitées. Rapporté par une récente étude, la majorité des publications de ce domaine (85%) sont encore dans des revues d'ingénierie 4. La performance des dispositifs microfluidiques n'a pas été assez convaincant pour la plupart des biologistes de passer de techniques actuelles, telles que le test Transwell et la glissière boîte de culture / verre macro-échelle à ce dispositif miniaturisé. La microfluidique est un domaine multidisciplinaire, ce qui nécessite des collaborations interdisciplinaires pour faire avancer ce domaine avant. L'objectif de cet article technique est de réduire les écarts de connaissances entre les disciplines et rendre les procédures de fabrication compréhensible par les biologistes, tout en assurant l'application biologique et la validation fonctionnelle des microvaisseaux microfluidiques. Les protocoles expérimentaux visualisés comprennent la fabrication des deux dispositifs microfluidiques et leurs utilitaires biologiques, ce qui représente une étroite collaboration entre les ingénieurs et les biologistes.
Nous avons récemment rapporté certainsapplications biologiques en utilisant le réseau de microvaisseaux in vitro avec dispositif microfluidique 5. Afin de concevoir de manière appropriée les dimensions du réseau de microcanaux et d'appliquer la contrainte de cisaillement souhaitée, un modèle numérique a été construit avec le logiciel de dynamique des fluides computationnelle pour estimer étroitement le profil d'écoulement. Les cellules primaires de la veine ombilicale humaines endotheliales (HUVEC) qui ont été ensemencés dans les microcanaux ont atteint la confluence, soit couvert l'ensemble des surfaces internes du micro – canal, en 3-4 jours avec une perfusion continue. La formation de la barrière adéquate a été démontrée par la VE-cadhérine et la coloration par rapport à ceux formés dans des conditions de culture cellulaire statiques et dans les microvaisseaux intactes. En appliquant les protocoles expérimentaux développés en microvaisseaux intacts perfusés individuellement 6-8, nous quantitativement mesuré les changements dans la CE [Ca2 +] i et de l'oxyde nitrique (NO) en réponse à l' adénosine triphosphate (ATP) avec fluorescent dansindicateurs et confocale et la microscopie par fluorescence conventionnelle. Les augmentations induites par un agoniste de la CE [Ca2 +] i et la production de NO ont été rapportés en tant que signaux intracellulaires nécessaires pour inflammatoires augmentations induites médiateur-en microvaisseaux perméabilité 6-15. Bien que certaines études antérieures ont montré des images de dispositifs microfluidiques DAF-2 DA chargés 16,17, la résolution et des données appropriées analyse n'a pas encore atteint 18 ans. À notre connaissance, cette étude démontre les premières mesures quantitatives de changement dynamique induite par l' agoniste en endothéliales [Ca 2+] i et la production de NO en utilisant microfluidique système basé.
Techniques de microfabrication ont la possibilité de fabriquer des microcanaux jusqu'à quelques microns et permettre le développement de modèles complexes pour imiter les géométries de microvascularisation in vivo. Ici, nous avons présenté un réseau de microcanaux typique avec trois niveaux de ramification. Cele réseau est fabriqué par la combinaison de la photolithographie, qui est réalisé dans une salle blanche de microfabrication et la lithographie molle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, nous présentons des protocoles détaillés pour le développement du réseau de microvaisseaux culture, la caractérisation des jonctions CE et cytosquelette distribution F-actine, et les mesures quantitatives des CE [Ca2 +] i et la production de NO en utilisant un dispositif microfluidique. Le dispositif microfluidique perfusé fournit un modèle in vitro qui permet une simulation proche des in vivo géométries de microvasculaires et des conditions d'…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le National Heart, Lung, and Blood Institute accorde HL56237, Institut national du diabète et de l'appareil digestif et maladies rénales Institut DK97391-03, National Science Foundation (NSF-1227359 et EPS-1003907).
Materials
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A929 | |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31 AA | |
| Bovine Albumin | MP Biomedicals | 810014 | |
| Bovine Brain Extract (BBE) | Lonza | CC-4098 | |
| Cover-slip | Fisher Scientific | 12-542C | |
| DAF-2 DA | Calbiochem | 251505 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody | Life technologies | A-11055 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| DRAQ5 (nuclei staining) | Cell Signaling Technology | 4084 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | Sigma-Aldrich | E2759-15MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
| Fluo-4 AM | Life technologies | F-14201 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750-078 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-548B | |
| Glass Pasteur pippette | VWR | 14672 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | |
| HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2517 | |
| Isopropyl alcohol (IPA) | VWR | 89125 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-081 | |
| Mammalian Ringer Solution Ingredient | |||
| NaCl (132 mM) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| KCL (4.6 mM) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 · 2H2O (2.0 mM) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 ·7H2O (1.2 mM) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Glucose(5.5 mM) | Fisher Scientific | BP350-1 | |
| NaHCO3 (5.0 mM) | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Hepes Salt (9.1 mM) | Research Organics | 6007H | |
| Hepes Acid (10.9 mM) | Research Organics | 6003H | |
| MCDB 131 Culture Medium | Life technologies | 10372-019 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phalloidin (F-actin staining) | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 14040-133 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| Scalpel | Exel Int | 29552 | |
| Scotch tape | 3M | 34-8711-3070-3 | |
| Silicon wafer | VWR | 14672 | |
| SU-8 photoresist | MicroChem | SU-8 2050 Y111072 | |
| SU-8 developer | MicroChem | Y020100 | |
| tissue culture flasks | Sigma-Aldrich | Z707503-100EA | |
| Triton X-100 | Chemical Book | T6878 | |
| Trypsin Neutralizer solution | Gibco | R-002-100 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Gibco | R-001-100 | |
| Tubing | Cole-Parmer | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD | |
| VE-cadherin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6458 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar hood | NuAire | NU-425 Class II, Type A2 | |
| CCD camera | Hamamatsu | ORCA | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SL | |
| Desiccator | Bel-Art | F42022 | |
| Hotplate | Wenesco | HP-1212 | |
| Incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Isotemp oven | Barnstead | 3608-5 | |
| Lithography bench | Karl Suss | MA6 Contact Lithography | |
| Optical microscope | Nikon | L200 ND & Diaphod 300 | |
| Shutter for the CCD camera | Sutter Instrument | Lambda 10-2 | |
| Plasma cleaner | PVA TePla/Harrick plasma | M4L/PDC-32G | |
| Spin coater | Brewer Science | Cee 200X | |
| Syringe pump system | Harvard Apparatus | 703005 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD 2015 | |
| CFD simulation software | COMSOL | COMSOL Multiphysics 4.0.0.982 | |
| Images acquire and analyse for NO production | Universal Imaging | Metafluor |
References
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