פיתוח ואפיון של<em> במבחנה</em> כלי דם קטן רשת מדידות כמותיות של האנדותל [Ca<sup> 2 +</sup>]<sub> i</sub> וייצור Nitric Oxide
Summary
Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.
Abstract
תאי האנדותל (EC) המצפים את דפנות כלי דם vivo חשופים כל זמן לזרום, אבל ECS בתרבית גדלה לעתים קרובות בתנאי סטטיים תערוכת פנוטיפ פרו-דלקתי. למרות הפיתוח של מכשירי microfluidic כבר אומץ על ידי מהנדסים למעלה משני עשורים, היישומים הביולוגיים שלהם יישארו מוגבלים. מודל microvessel במבחנה רלוונטי יותר פיסיולוגי אומת על ידי יישומים ביולוגיים חשוב לקדם את התחום ולגשר על הפערים בין in vivo ו במבחנה. כאן, אנו מציגים נהלים מפורטים לפיתוח רשת microvessel בתרבית באמצעות מכשיר microfluidic עם יכולת זלוף לטווח ארוך. אנחנו גם מדגימים ושימושיה מדידות כמותיות של שינויים המושרה אגוניסט ב EC [Ca 2 +] i ו תחמוצת החנקן (NO) בזמן אמת באמצעות confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונאלי. רשת microvessel נוצרהעבודה עם זלוף הרציף הראתה צמתים מפותחות בין ECS. VE-cadherin הפצה היה קרוב יותר לזה שנצפה microvessels השלם מ monolayers EC בתרבית באופן סטטי. ATP-induced עלייה זמנית EC [Ca 2 +] i ו NO ייצור נמדדו כמותית ברמות תאים בודדות, אשר תוקפות את הפונקציונליות של microvessels התרבותי. מכשיר microfluidic זה מאפשר ECS לגדול תחת זרם רלוונטי מבוקר היטב, מבחינה פיזיולוגית, מה שהופך את סביבת תרבית תאים קרוב in vivo מזה בתרבויות 2D הקונבנציונליות, סטטי. עיצוב רשת microchannel הוא תכליתי מאוד, ותהליך הייצור הוא פשוט דיר. המכשיר ניתן לשלב בקלות למערכת המיקרוסקופית confocal או קונבנציונלית המאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה. והכי חשוב, כי רשת microvessel התרבותית יכולה להיוצר על ידי ECS אדם מן המעלה הראשונה, גישה זו תשמש ככלי שימושי כדי לחקור כיצדפתולוגית מרכיבי דם שינו ממדגמים חולים להשפיע ECS אדם ולספק תובנה בנושאים קליניים. כמו כן ניתן לפתח כפלטפורמת הקרנת סמים.
Introduction
תאי האנדותל (EC) המצפים את דפנות כלי דם vivo חשופים כל זמן לזרום, אבל ECS בתרבית גדלה לעתים קרובות בתנאי סטטיים תערוכת פנוטיפ פרו-דלקתי 1,2. טכנולוגית מיקרופלואידיקה מאפשרת נוזל לשלוט באופן מדויק באמצעות microscale המוגבל גיאומטרי ערוצים (תת מילימטר) 3, אשר מספק את ההזדמנות עבור תאים בתרבית, במיוחד עבור כלי דם ECS, לגדול בתנאי זרימה רצויות. תכונות אלו הופכות את תנאי תרבית תאים קרובים in vivo מ בתרביות תאי 2D הקונבנציונליות, סטטי. הם מאוד חשובים כאשר מכשירי microfluidic משמשים מודל סוגים שונים של vasculatures וללמוד תגובות EC גירויים מכאניים ו / או כימיים.
למרות היתרונות שמפגינים רשת microchannel על תרבית תאים סטטי, העיבוד ויישום של מיקרופלואידיקה ב- F ביוield להישאר מוגבל. דווח ע"י בדיקה שנערכה לאחרונה, רוב הפרסומים בתחום זה (85%) עדיין בכתבי עת הנדסה 4. הביצועים של מכשירי microfluidic לא היו מספיק משכנע עבור רוב הביולוגים לעבור טכניקות נוכחיות כגון assay Transwell ואת מנת תרבות מאקרו בקנה המידה / זכוכית שקופית למכשיר מיניאטורי זה. מיקרופלואידיקה הוא שדה רב תחומי, המחייב שיתוף פעולה בינתחומי לנוע בתחום זה קדימה. מטרת מאמר טכני זה היא לצמצם את פערי הידע בין דיסציפלינות ולבצע את הליכי הייצור מובנים על ידי ביולוגים, תוך מתן יישום ביולוגי ואימות פונקציונלית של microvessels microfluidic. הפרוטוקולים הניסיונות דמיינו כוללים ייצור של שני מכשירים microfluidic והמקודדים הביולוגיים שלהם, אשר מייצג שיתוף פעולה הדוק בין מהנדסים וביולוגים.
אנחנו דיווחנו לאחרונה כמהיישומים ביולוגיים באמצעות רשת microvessel במבחנה עם המכשיר microfluidic 5. על מנת לעצב את הממדים כראוי של רשת microchannel ולהחיל את לחץ הגזירה הרצוי, מודל מספרים נבנה עם תוכנה הידרודינמיקה חישובית להעריך את פרופיל הזרימה מקרוב. תאי אנדותל טבור וריד אדם מן המעלה הראשון (HUVECs) כי היו זורעים לתוך microchannels הגיע למפגש, כלומר כיסו את המשטחים הפנימיים כולו של microchannel, בתוך 3-4 ימים עם זלוף הרציף. היווצרות המחסום הנאותה הודגמה על ידי מכתים VE-cadherin בהשוואה לאלו שנוצרו בתנאי תרבית תאי סטטי ב microvessels ללא פגע. על ידי יישום פרוטוקולי הניסוי שפותח microvessels שלמים perfused בנפרד 6-8, אנחנו כמותית למדוד את השינויים EC [Ca 2 +] i ו תחמוצת החנקן (NO) בתגובה אדנוזין אדנוזין (ATP) עם ניאוןdicators ו confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונאלי. העליות נגרמות אגוניסט ב EC [Ca 2 +] i ו NO ייצור דווחו כאותות תאיים הכרחיים עקב השפעות מתווך דלקת בחדירות microvessel 6-15. למרות שמחקרים קודמים הראו כמה תמונות של DAF-2 DA מכשירי microfluidic טעונים 16,17, ניתוח ברזולוציה ונתונים המתאים טרם השיג 18. למיטב ידיעתנו, מחקר זה מדגים את מדידות כמותיות הראשונות של שינוי הדינמי הנגרמת אגוניסט ב האנדותל [Ca 2 +] i ו NO microfluidic ניצול ייצור מערכת מבוססת.
יש טכניקות microfabrication את הגמישות לפברק למטה microchannels כדי מיקרונים אחדים ולאפשר פיתוח של תבניות מורכבות לחקות את הגיאומטריות של microvasculature in vivo. כאן הצגנו רשת microchannel טיפוסית עם שלוש רמות של הסתעפות. זֶהרשת הוא מפוברק על ידי השילוב של photolithography אשר מתבצע חדר נקי microfabrication ו ליתוגרפיה רכה.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים לפיתוח רשת microvessel התרבותי, האפיון של צמתי EC ו cytoskeleton הפצת F- תקטין, ואת מדידות כמותיות של EC [Ca 2 +] i ו NO ייצור באמצעות מכשיר microfluidic. מכשיר microfluidic perfused מספק מודל במבחנה המאפשר סימולציה קרובה של גיאומטריות כלי דם <em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הלאומי ללב, ריאות ודם המכון מעניק HL56237, המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול כליות מכון DK97391-03, הקרן הלאומית למדע (NSF-1,227,359 והרווח למניה-1,003,907).
Materials
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A929 | |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31 AA | |
| Bovine Albumin | MP Biomedicals | 810014 | |
| Bovine Brain Extract (BBE) | Lonza | CC-4098 | |
| Cover-slip | Fisher Scientific | 12-542C | |
| DAF-2 DA | Calbiochem | 251505 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody | Life technologies | A-11055 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| DRAQ5 (nuclei staining) | Cell Signaling Technology | 4084 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | Sigma-Aldrich | E2759-15MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
| Fluo-4 AM | Life technologies | F-14201 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750-078 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-548B | |
| Glass Pasteur pippette | VWR | 14672 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | |
| HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2517 | |
| Isopropyl alcohol (IPA) | VWR | 89125 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-081 | |
| Mammalian Ringer Solution Ingredient | |||
| NaCl (132 mM) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| KCL (4.6 mM) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 · 2H2O (2.0 mM) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 ·7H2O (1.2 mM) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Glucose(5.5 mM) | Fisher Scientific | BP350-1 | |
| NaHCO3 (5.0 mM) | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Hepes Salt (9.1 mM) | Research Organics | 6007H | |
| Hepes Acid (10.9 mM) | Research Organics | 6003H | |
| MCDB 131 Culture Medium | Life technologies | 10372-019 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phalloidin (F-actin staining) | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 14040-133 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| Scalpel | Exel Int | 29552 | |
| Scotch tape | 3M | 34-8711-3070-3 | |
| Silicon wafer | VWR | 14672 | |
| SU-8 photoresist | MicroChem | SU-8 2050 Y111072 | |
| SU-8 developer | MicroChem | Y020100 | |
| tissue culture flasks | Sigma-Aldrich | Z707503-100EA | |
| Triton X-100 | Chemical Book | T6878 | |
| Trypsin Neutralizer solution | Gibco | R-002-100 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Gibco | R-001-100 | |
| Tubing | Cole-Parmer | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD | |
| VE-cadherin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6458 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar hood | NuAire | NU-425 Class II, Type A2 | |
| CCD camera | Hamamatsu | ORCA | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SL | |
| Desiccator | Bel-Art | F42022 | |
| Hotplate | Wenesco | HP-1212 | |
| Incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Isotemp oven | Barnstead | 3608-5 | |
| Lithography bench | Karl Suss | MA6 Contact Lithography | |
| Optical microscope | Nikon | L200 ND & Diaphod 300 | |
| Shutter for the CCD camera | Sutter Instrument | Lambda 10-2 | |
| Plasma cleaner | PVA TePla/Harrick plasma | M4L/PDC-32G | |
| Spin coater | Brewer Science | Cee 200X | |
| Syringe pump system | Harvard Apparatus | 703005 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD 2015 | |
| CFD simulation software | COMSOL | COMSOL Multiphysics 4.0.0.982 | |
| Images acquire and analyse for NO production | Universal Imaging | Metafluor |
References
- Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
- Michel, C. C., Curry, F. E. Microvascular permeability. Physiol Rev. 79, 703-761 (1999).
- Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater Today. 8, 50-56 (2005).
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507, 181-189 (2014).
- Li, X., Xu, S., He, P., Liu, Y. In vitro recapitulation of functional microvessels for the study of endothelial shear response, nitric oxide and [Ca2+]I. PLoS One. 10, 0126797 (2015).
- He, P., Pagakis, S. N., Curry, F. E. Measurement of cytoplasmic calcium in single microvessels with increased permeability. Am J Physiol. 258, 1366-1374 (1990).
- Zhou, X., He, P. Improved measurements of intracellular nitric oxide in intact microvessels using 4,5-diaminofluorescein diacetate. Am J Physiol-Heart C. 301, 108-114 (2011).
- Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of Applied Physiology. 113, 1110-1120 (2012).
- He, P., Zhang, X., Curry, F. E. Ca2+ entry through conductive pathway modulates receptor-mediated increase in microvessel permeability. Am J Physiol. 271, 2377-2387 (1996).
- Zhou, X., He, P. Endothelial [Ca2+]i and caveolin-1 antagonistically regulate eNOS activity and microvessel permeability in rat venules. Cardiovasc Res. 87, 340-347 (2010).
- Zhu, L., He, P. Platelet-activating factor increases endothelial [Ca2+] i and NO production in individually perfused intact microvessels. Am J Physiol-Heart C. 288, 2869-2877 (2005).
- He, P., Curry, F. E. Depolarization modulates endothelial cell calcium influx and microvessel permeability. Am J Physiol. 261, 1246-1254 (1991).
- He, P., Curry, F. E. Endothelial cell hyperpolarization increases [Ca2+]i and venular microvessel permeability. J Appl Physiol. 76 (1985), 2288-2297 (1994).
- Xu, S., Zhou, X., Yuan, D., Xu, Y., He, P. Caveolin-1 scaffolding domain promotes leukocyte adhesion by reduced basal endothelial nitric oxide-mediated ICAM-1 phosphorylation in rat mesenteric venules. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305, 1484-1493 (2013).
- Zadeh, M. H., Glass, C. A., Magnussen, A., Hancox, J. C., Bates, D. O. VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial Cells In Vitro are Inhibited by Dominant Negative TRPC6. Microcirculation. 15, 605-614 (2008).
- Tsai, M., et al. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of clinical investigation. 122, 408-418 (2012).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13, 1489-1500 (2013).
- D’Amico Oblak, T., Root, P., Spence, D. M. Fluorescence monitoring of ATP-stimulated, endothelium-derived nitric oxide production in channels of a poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic device. Analytical chemistry. 78, 3193-3197 (2006).
- Zhou, X. P., Yuan, D., Wang, M. X., He, P. N. H2O2-induced endothelial NO production contributes to vascular cell apoptosis and increased permeability in rat venules. Am J Physiol-Heart C. 304, 82-93 (2013).
- Lee, P. J., Hung, P. J., Rao, V. M., Lee, L. P. Nanoliter scale microbioreactor array for quantitative cell biology. Biotechnol Bioeng. 94, 5-14 (2006).
- Zakrzewicz, A., Secomb, T. W., Pries, A. R. Angioadaptation: Keeping the Vascular System in Shape. Physiology. 17, 197-201 (2002).
- Lipowsky, H. H., Kovalcheck, S., Zweifach, B. W. The distribution of blood rheological parameters in the microvasculature of cat mesentery. Circulation Research. 43, 738-749 (1978).
- Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr Biol (Camb). 7, 525-533 (2015).
- McCann, J. A., Peterson, S. D., Plesniak, M. W., Webster, T. J., Haberstroh, K. M. Non-uniform flow behavior in a parallel plate flow chamber : alters endothelial cell responses. Ann Biomed Eng. 33, 328-336 (2005).
- Curry, F. E. Modulation of venular microvessel permeability by calcium influx into endothelial cells. FASEB J. 6, 2456-2466 (1992).
- Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).
- Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).
- Myers, D. R., et al. Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases. J Vis Exp. , (2012).
- Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks. Jove-J Vis Exp. , e51025 (2014).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB). Lab on a Chip. 12, 5282-5282 (2012).
- Shao, J. B., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).
- Yeon, J. H., et al. Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures. Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).
- Golden, A. P., Tien, J. Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element. Lab Chip. 7, 720-725 (2007).
- Zheng, Y., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).
- Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients. Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).
