Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörlerinin Değerlendirilmesi için Basit Biyoassay
Summary
Biz, tespit miktarının ve ligandların vasküler endotelyal büyüme faktörü ailesinin üyelerinin aktivitesini izlemek için basit bir hücre bazlı biyolojik tayini açıklamaktadır. Deney ligand ile reseptör ve çapraz bağlama bir yarı-nicel veya kantitatif bir değerlendirmesini sağlamak için bir faktör bağımlı hücre hattı içinde ilave kimerik reseptörler kullanır.
Abstract
vasküler biyolojide rol oynayan reseptör tirozin kinazlar ve bunların etkileşime giren ligandlar analizi ilişkili reseptörlerin ilgili ligandların geniş bir yelpazesi ve özel bir endotel hücrelerinin primer kültürleri ile ilgili zorluk ailesine yapısal ifadesi genellikle zordur. Burada, vasküler endotel büyüme faktörü reseptör-2 (VEGFR-2), anjiyogenez ve lenfanjiyogenezin teşvik sinyallerin önemli bir transdüktör ligandların belirlenmesi için bir biyolojik tayini açıklamaktadır. transmembran ve eritropoietin reseptörü (EPOR) sitoplazmik bölgeleri ile VEGFR-2'nin hücre dışı (ligand bağlayıcı) bölgesinin bir füzyonunu kodlayan bir cDNA faktör bağımlı hücre çizgisi Ba / F3 olarak ifade edilir. Bu hücre hattı, 24 saat içinde hücrelerin ölümü ile interlökin-3 (IL-3) ve bu etken sonuçların çekilmesine mevcudiyetinde artmaktadır. VEGFR-2 / EPOR reseptör füzyon ekspresyonu hayatta kalma ve potentia teşvik etmek için alternatif bir mekanizma sağlarbağlanması ve füzyon proteini (yani, bir olabilir çapraz bağlantı VEGFR-2 hücre dışı bölgesi) hücre dışı kısmının çapraz bağlama yeteneğine sahip bir ligand mevcudiyetinde kararlı bir şekilde transfekte edilmiş Ba / F3 hücrelerinin lly çoğalması. ligand ve küçük hücre hacimleri, 24 saat hızlı bir sonucu imkan veren bir yarı-kantitatif bir yaklaşım, bir canlı hücre sayısı temsili göstergeler içeren kantitatif bir yaklaşım: deney iki yolla gerçekleştirilebilir. deney yapmak için nispeten kolaydır, bilinen VEGFR-2 ligandları yüksek ölçüde duyarlı ve VEGFR-2 gibi reseptör veya ligand ve çözülebilir bağ trans monoklonal antikorlar gibi sinyal hücre dışı inhibitörleri barındırabilir.
Introduction
salgılanan protein, büyüme faktörleri ve aynı kökenli hücre yüzeyi reseptörlerinin, vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) ailesinin eriyebilir ligandların ve membrana gömülü reseptörler, hücre membranları üzerinde işaretlerinin transdüklenmesinden sırasıyla bu işlev önemli ve farklı bir gruptur. Bu endotel hücreleri, aynı zamanda epitel kaynaklı hücreler ve bağışıklık sistemi 1,2 kişilerce temel olarak işlev görür. sık görülen klinik kullanımda bunları hedefleyici ligand ile aktive edilen VEGF reseptörleri (VEGFR), yaşa bağlı makula dejenerasyonu ve kanser gibi önemli hastalığı, kritiktir ve terapötik tarafından angaje sinyal yollannın (örn, VEGF-A hedef monoklonal antikoru bevakizumab) 3,4.
VEGF ailesinin karmaşıklığını bir doğada bulunan çözülebilir ligandlan (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, parapox virüs ailesi ORF ve yılan zehiri VEGF, artı diğer tarafından kodlanan VEGF proteinlerinin çeşitliliğidir inhibitörVEGF-A) 2 izoformları.
Bu ligandlar yani reseptör tirozin kinaz ailesinin üç üyesi, VEGFR-1, VEGFR-2 ve VEGFR-3 ile etkileşim. Bu reseptörler değişken, farklı hücre tiplerinde ifade edilir fakat genellikle tüm boyutları 5, kan ve lenf damarları kaplayan endotel hücrelerinin yüzeyi üzerinde birlikte ifade edilmiştir. VEGFR-2, memeli VEGF-A 6, VEGF-C ve VEGF-7 D 8,9 olarak orf VEGF 10 ve yılan zehiri VEGF 11 ligandlarına bağlanabildiği. VEGFR-2 anjiyojenez, embriyonik gelişme (daha önceden mevcut damarlardan yeni kan damarlarının büyümesi), yara iyileşmesi, kanser ve göz hastalıkları sürüş önemli bir rol oynar. Bu bağlamda, bu tür VEGF-A, -C ve D bir bağ olarak ve ligandlar, kan damar endotel hücreleri 12-15 reseptörünü aktive eder. Lenfatik endotel hücreleri üzerinde VEGFR-2 lenfanjiyogenezin rol yeni lenfatik damarların 16 oluşumunu oynar. VEGFR-2 de dilatasyon ve sağlıklı doku ve hastalık 17 büyük arterlerin ve lenfatiklerden genişlemesini teşvik edebilir. VEGFR-2'nin tam bir anlayış: ligand etkileşimleri anjiojen bağımlı hastalıklar 18 iyileştirilmesinde kullanım için inhibitörlerin geliştirilmesi için önemlidir. VEGFR-2'ye, VEGF-A bağlama en izoformlar, VEGF-C ve VEGF-D proteolitik bölünme VEGFR-2 19,20 yüksek afıniteli bağlanma sergiler VEGF-homoloji alanı kapsayan bir fragman serbest bırakmak için gerekli olsa da.
Biz 21 (özel ortam gerektiren) birincil endotel pasaja teknik olarak zor olan hücreler, satın almak için pahalı ve kültür ihtiyacını aşmak için tasarlanmıştır VEGFR-2'nin ligandlar izlemek için bir biyoassay geliştirilen ve çoklu VEGFR'yi ifade ve ko- ilişkili olan 22 reseptörleri. saplama amacıyla, diğer VEGF reseptörleri ya da ko-reseptörleri ile VEGFR-2'nin heterodimerizasyon istenmeyen karmaşıklık neden olabilirY çift reseptör-ligand etkileşimleri, spesifik bir reseptöre bağlanabilir etkinliğini ya da önleyici reaktifler etkisini değerlendirmek. 23. biyo-deney hücre membranında ilgili alıcı hareketliliğini koruyan ve bir ligand en bağlanma yeteneği ve çapraz-link VEGFR-2 hücre dışı bölgesinin değerlendirme sağlar.
biyo-deney (bu durumda, VEGFR-2), bir VEGF reseptörünün hücre dışı bölgesi transmembran ve eritropoietin reseptörü (EPOR), sitokin reseptör ailesinin bir üyesi hücre içi bölgeleri ile birleştirildiği edildiği bir kimerik reseptörünün oluşturulması dayanır 8,24. Bu füzyon proteini daha sonra, faktör bağımlı ön-B hücre hattı Ba / F3 olarak ifade edilir bağlanması ve reseptörün hücre dışı alanı edebilen sitoplazmik efektör bölge aktivasyonuna neden olan çapraz bağlama yeteneğine sahip bir ligand ile bu stimülasyon üzerine hücreyi tanıtmak için Janus kinazlar (JAK) aracılığıyla bir hayatta kalma sinyal nakletmehayatta kalması ve / veya çoğalması. Bunun aksine, ligand ile tam uzunlukta VEGFR-2, aynı hücre tipinde ve stimülasyon sentezleme, VEGFR-2 yolunun yakın sinyal efektörleri, bu hücre tipinde uygun olmadıklarını gösteren hücre hayatta kalma ve proliferasyon teşvik etmez.
Bu yeni VEGFR-2 ligand 10,19,20,24-29 bağlanmasını keşfetmek için bağlamlarda çeşitli tahlili kullanılmıştır. Bir VEGFR-3-EPOR-Ba / F3 tahlili ile birlikte, bağlayıcı ve VEGFR-2 ve VEGFR-3 30 çapraz bağlama için göreceli VEGF-C'nin etkinliklerini ve VEGF-D büyüme faktörleri karşılaştırılmıştır. Deney VEGFR-2 veya VEGF-D, çözülebilir VEGFR-2 tutucu ve VEGF ailesi 31 hedefleme peptidomimetikleri monoklonal antikorların nötralize edici inhibitör aktivitesinin karakterize edilmesi için kullanılmıştır. Tahlil, aynı zamanda primer endotel hücreleri bağlanan farklı orf soylarından VEGF'lerinde yeteneğini ve çapraz bağ VEGFR-2, test öncesi göstermek için kullanılan <s> 10,26 kadar. Deney daha zahmetli endotel hücre deneyleri 25 ya da temizleme büyüme değerlendirmek protokolleri 27 faktörleri sunulmadan önce hızlı bir şekilde aktivitesi için değerlendirilebilir VEGF'lerinde mutantlarının süratle taranması için özellikle yararlıdır.
Bu tarif deney uygulaması kolaydır, ve yarı-kantitatif versiyonu büyüme faktörleri, antikorlar ya da başka deneyler için çözünebilir reseptör alanlarının üretim veya saflaştırma takip bazen gereklidir pratik belirlemeleri için izin verir. tahlilinde kullanım kolaylığı spesifik dokular veya organ sistemleri ile kan veya lenf damarları türetilen primer endotel hücreleri ile yapılan daha fazla ve daha eksiksiz çalışmalar için ideal bir tamamlayıcısı yapar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada tarif edilen deney, büyüme faktörleri bağlı olan yüksek canlılığının hücreleri kullanılarak dayanır. Hücreler, bu yüzden faktör bağımlı olmasını sağlamak, ve kimerik reseptörünün ekspresyonunu korumak için dikkatli bir şekilde kültüre edilmesi gerekebilir. orta taze yapılmış ve aşırı uzun süre ve WEHI-3D CM önemli derece aktif olduğunu depolanmaz sağlanması. Hücreler, iyice tahlisiye ligandlarına hücrelerin maruz zaman kalıntı, IL-3 tahlili kontamine olmasını …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SAS and MGA are supported by Project Grants, a Program Grant and Research Fellowships from the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), and by funds from the Operational Infrastructure Support Program provided by the Victorian Government, Australia. MMH has support from a Peter MacCallum Foundation Grant.
Materials
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer |
| G418 Sulphate (Geneticin) | Invivogen | ant-gn-5 | Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties. |
| 3H-Thymidine | PerkinElmer | NET-027 | This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation |
| Vialight Plus Kit | Lonza | LT07-221 | Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent |
| Prestoblue Cell Viability Reagent | Invitrogen | A13261 | Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell |
| Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) | Thermo Scientific | 136528 | Small microtitre plate |
| 96 well Tissue Culture Plate | Falcon, Corning Inc. | 353072 | |
| DMEM (1X) | Gibco | 11965-92 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
| Cell Harvester | Tomtec Life Sciences | N/A | Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester |
| Liquid Scintillation Counter | LKB Wallac | 1205 | LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter |
| UniFilter-96 GF/B | Perkin Elmer | 6005177 | White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize |
| Gentamicin | Gibco, Life Technologies | 15750-060 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.22um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit | Costar, Corning Inc. | 8160 | Centrifuge tube filters have a 0.22µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500µl capacity polypropylene microcentrifuge tube. |
| Fluorescence Reader | BioTek | N/A | BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader |
References
- Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 9, 669-676 (2003).
- Achen, M. G., Stacker, S. A. Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance. Growth Factors. 5, 283-296 (2012).
- Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration. Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).
- Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).
- Korpelainen, E. I., Alitalo, K. Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 10, 159-164 (1998).
- Senger, D. R., et al. Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid. Science. 219, 983-985 (1983).
- Joukov, V., et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J. 15, 290-298 (1996).
- Achen, M. G., et al. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4). Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).
- Leppanen, V. M., et al. Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity. Blood. 117, 1507-1515 (2011).
- Wise, L. M., et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).
- Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2). J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).
- Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K. Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Nat Rev Cancer. 2, 573-583 (2002).
- Stacker, S. A., et al. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nat Med. 7, 186-191 (2001).
- Skobe, M., et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis. Nat Med. 7, 192-198 (2001).
- Mandriota, S. J., et al. Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis. EMBO J. 20, 672-682 (2001).
- Stacker, S. A., et al. Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer. Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).
- Karnezis, T., et al. VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium. Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).
- Folkman, J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).
- Stacker, S. A., et al. Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers. J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).
- McColl, B. K., et al. Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D. J Exp Med. 198, 863-868 (2003).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).
- Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).
- Pacifici, R. E., Thomason, A. R. Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand. J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).
- Stacker, S. A., et al. A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability. J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).
- Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding. J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).
- Wise, L. M., et al. Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens. J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).
- Davydova, N., et al. Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies. Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).
- Baldwin, M. E., et al. Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis. J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).
- Baldwin, M. E., et al. The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man. J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).
- Makinen, T., et al. Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3. EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).
- Achen, M. G., et al. Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3. Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).
- Bamford, S., et al. The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website. Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).
- Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2010).
